Основи гістології

Зміст

Вступ

1. Історія гістології як науки

2. Предмет, завдання і проблеми гістології

3. Методи гістологічних досліджень

3.1 Об'єкти досліджень

3.2 Світлова мікроскопія

3.3 Електронна мікроскопія

3.4 Методи дослідження фіксованих клітин і тканин

3.5 Методи дослідження живих клітин і тканин

4. Приготування гістологічного матеріалу

4.1 Зрізи

4.2 Фарбування гістологічніх препаратів

4.3 Просвітлення і висновок зрізів

5. Взяття і фіксація гістологічного матеріалу

5.1 Техніка вирізки матеріалу

5.2 Техніка фіксації матеріалу

Висновок

Список використаної літератури

гістологія мікроскопія клітина зріз

Вступ

Гістологія, наука, що займається вивченням тканин тварин. Тканиною називають групу клітин, подібних за формою, розмірами і функцій і по продуктах своєї життєдіяльності. У всіх рослин і тварин, за винятком самих примітивних, тіло складається з тканин, причому у вищих рослин і у високоорганізованих тварин тканини відрізняються великою різноманітністю структури і складністю своїх продуктів; поєднуючись один з одним, різні тканини утворюють окремі органи тіла.

Гістологію іноді називають мікроскопічною анатомією, оскільки вона вивчає будову (морфологію) організму на мікроскопічному рівні (об'єктом гістологічного дослідження служать дуже тонкі тканинні зрізи і окремі клітини). Хоча ця наука насамперед описова, в її завдання також входить інтерпретація тих змін, які відбуваються в тканинах в нормі та патології. Тому гістологу необхідно добре розбиратися в тому, як формуються тканини в процесі ембріонального розвитку, яка їхня здатність до зростання в постембріональний період і яким вони піддаються змінам в різних природних і експериментальних умовах, у тому числі в ході свого старіння і загибелі складових їх клітин.

Історія гістології як окремої гілки біології тісно пов'язана зі створенням мікроскопа і його вдосконаленням. М. Мальпігі (1628-1694) називають "батьком мікроскопічної анатомії", а отже гістології. Гістологія збагачувалася спостереженнями і методами дослідження, що проводилися або створювалися багатьма вченими, основні інтереси яких лежали в області зоології чи медицини. Про це свідчить гістологічна термінологія, увічнити їх імена в назвах вперше описаних ними структур або створених методів: острівці Лангерганса, ліберкюнові залози, купферові клітини, мальпігіевий шар, забарвлення по Максимову, забарвлення по Гімза і т.п.

В даний час набули поширення методи виготовлення препаратів та їх мікроскопічного дослідження, що дають можливість вивчати окремі клітини. До таких методів належать техніка заморожених зрізів, фазовоконтрастна мікроскопія, гістохімічний аналіз, культивування тканин, електронна мікроскопія; остання дозволяє детально вивчати клітинні структури (клітинні мембрани, мітохондрії та ін.). Актуальними завданнями гістології є:

Розробка загальної теорії гістології, що відбиває еволюційну динаміку тканин і закономірності ембріонального і постнатального гістогенезу;

Вивчення гістогенезу як комплексу координованих у часі та просторі процесів проліферації, диференціації, детермінації, інтеграції, адаптивної мінливості, програмованої загибелі клітин і ін.;

З'ясування механізмів гомеостазу і тканинної регуляції (нервової, ендокринної, імунної), а також вікової динаміки тканин;

Вивчення закономірностей реактивності і адаптивної мінливості клітин і тканин при дії несприятливих екологічних факторів і в екстремальних умовах функціонування та розвитку, а також при трансплантації;

Розробка проблеми регенерації тканин після пошкоджуючих впливів і методів тканинної замісної терапії;

Розкриття механізмів молекулярно-генетичної регуляції клітинної диф-ференцировки, успадкування генетичного дефекту розвитку систем, розробка методів генної терапії і трансплантації стовбурових ембріональних клітин;

1. Історія гістології як науки

Виділяють три етапи у розвитку гістології на підставі застосування різної оптичної техніки:

.Домікроскопіческій період (з IV ст. До н. Е. По 1665) пов'язаний з іменами Аристотеля, Галена, Авіценни, Везалія, Фаллопия і характеризується спробами виділення в організмі тварин і людини неоднорідних тканин (твердих, м'яких, рідких і так далі) і використанням методів анатомічного препаруваня ;

. Мікроскопічний, тривав близько 300 років. Початок пов'язано з конструюванням перших мікроскопів і по удосконалення сучасних Успіхи гістології як науки про будову і походження тканин та їх компонентів насамперед пов'язані з розвитком техніки, оптики і методів мікрокопіювання. Мікроскопічні дослідження дозволили накопичити дані про будову клітин і тканин організму і на цій підставі зробити теоретичні узагальнення. Перші мікроскопи були створені на початку XVII ст. (Г. та З. Янсени, Г. Галілей та ін.). Одне з найбільш ранніх наукових досліджень за допомогою мікроскопа власної конструкції провів англійський вчений Роберт Гук (1635-1703). Він вивчав мікроскопічну будову багатьох предметів, серед яких були вістрі голки, батист, пісок в сечі, насіння маку, мурахи, деревина та багато інших. Всі вивчені об'єкти Р. Гук описав у книзі "Мікрографія або деякі фізіологічні описи найдрібніших тіл, виконані при посередництві збільшувальних скелець ...", виданої в 1665 р Зі своїх спостережень Р. Гук зробив висновок про широке поширення пухирчастих осередків у рослинних об'єктах і вперше запропонував термін "клітина". У 1671 р англійський учений Н. Грю (1641-1712) в своїй книзі "Анатомія рослин" писав про клітинну будову як про загальний принцип організації рослинних організмів. Н. Грю вперше ввів у вживання термін "тканина" для позначення рослинної маси, оскільки остання нагадувала за своєю мікроскопічною конструкцією тканини одягу. У тому ж році італієць Дж. Мальпігі (1628-1694) дав систематичний і детальний опис пористої (клітинної будови різних рослин. Надалі поступово накопичувалися факти, що свідчать про те, що не тільки рослинні, а й тваринні організми складаються з клітин. У другій половині XVII ст. оптик-любитель А. Левенгук (1632-1723) відкрив світ мікроскопічних тварин і вперше описав червоні кров'яні тільця і чоловічі статеві клітини. Кожне дослідження по суті було відкриттям, яке погано уживалося з метафізичним поглядом на природу, що складалися століттями. Випадковий характер відкриттів, недосконалість мікроскопів, метафізичий світогляд не дозволили протягом 100 років (з середини XVII до середини XVIII ст.) Зробити суттєві кроки вперед у пізнанні закономірностей будови тварин і рослин.

Велике значення для розвитку знань про мікроскопічну будову організмів мало подальше удосконалення мікроскопів. У XVIII в. мікроскопи виготовлялися вже у великій кількості. До Росії вони вперше були привезені з Голландії Петром I. Пізніше при Академії наук в Петербурзі була організована майстерня з виготовлення мікроскопів. Для розвитку мікроскопії багато чого зробив М. В. Ломоносов, який запропонував ряд технічних удосконалень конструкції мікроскопа і його оптичної системи. Так, в кінці XVIII - початку XIX ст. були створені ахроматичні мікроскопи, які зробили більш достовірними мікроскопічні спостереження і дозволили перейти до систематичного вивчення структурних елементів найрізноманітніших тварин і рослинних організмів. У XIX ст. великий вплив на розвиток вчення про клітині і тканинах надали роботи Я. Пуркіньє (1787-1869), М. Шлейдена (1804-1881), Ф. Лейдига (1821- 1908), І. Мюллера (1801-1858), Т. Шванна (1810-1882), Р. Вирхова (1821-1902), Р.Келлікера (1817-1905), В. Вальдейера (1836-1921) та ін. Хоча багато дослідників висловлювали припущення про клітинну будову організмів, тільки Т. Шванн в своїй монографії "Мікроскопічне дослідження про відповідність у структурі і зростанні тварин і рослин" (1839) ясно сформулював основні положення так званої клітинної теорії. Найважливіший висновок даної теорії полягав у тому, що клітини являють собою елементарні універсальні структурні одиниці всіх рослин і тварин. Незабаром після опублікування книги Т. Шванна австрійський гістолог А.Келлікер поширив положення клітинної теорії на ранні стадії ембріонального розвитку організму. У 1841-1844 рр. він показав, що сперматозоїд і яйце є клітинами. З клітин складається і організм (зародок), що виникає в ході дроблення заплідненої жіночої статевої клітини.

Паралельно з розвитком клітинної теорії складалися уявлення про те, що клітини в складі організму утворюють системи вищого порядку - тканини. У 1801 р французький анатом М. Ф. К. Біша (1771-1802) на основі мікроскопічних досліджень запропонував першу класифікацію тканин. Його учень К. Майер ввів термін "гістологія" у виданому в 1819 р праці "Про гістоло-гии і новому підрозділі тканин людського тіла". Створення клітинної теорії справила величезний прогресивний вплив на розвиток біології та медицини. У середині XIX в. почався період бурхливого розвитку описової гістології. На основі клітинної теорії були вивчені складу різних органів і тканин, їх розвиток, що дозволило вже тоді створити в основних рисах мікроскопічну анатомію і уточнити класифікацію тканин з урахуванням їх мікроскопічної будови (А. Келлікер та ін.). Однак наукова думка в другій половині XIX ст. не могла плідно розвиватися без подальших успіхів гістологічної техніки і методів мікроскопічного дослідження. У цей період були введені в практику і вдосконалені водні і масляні імерсійним об'єктиви, винайдений мікротом, застосовані нові фіксатори (формалін, осмієва кислота, хромова кислота). Дуже плідним виявився метод імпрегнації солями срібла, розроблений італійським вченим К.Гольджі, що описав внутрішньоклітинний сітчастий апарат (комплекс Гольджі). Цей метод і його модифікації дозволили провести фундаментальні дослідження нервової системи (Р. Кахаль) і створити основи нейрогістології. Визнанням наукових заслуг К. Гольджі і Р. Кахаля стало присудження їм в 1906 р Нобелівської премії. В останній чверті XIX в. були відкриті й інші органели клітини.

Завдяки успіхам в галузі вивчення будови клітини в кінці XIX ст. були закладені основи цитології, але мікроскопірованіе фіксованих кліток не дозволяло судити про процеси життєдіяльності в них. Тому увагу вчених привернули методи культивування клітин і тканин (І. П. Скворцов, Р. Гаррісон, А. Каррель та ін.). Методи прижиттєвого введення барвників, застосовані багатьма дослідниками в той час, введення чужорідних тіл в організм і інші методи уможливили вивчення фізіології гістологічних структур. У 1900 р Н. М. Гайдукова був запропонований метод микроскопирования живих об'єктів в темному полі. В цей же час був винайдений мікроманіпулятор, за допомогою якого можна було проводити операції на окремих клітках (видалення ядер, розрізи клітин та ін.) З метою з'ясування ролі і значення їх у життєдіяльності організму. На початку 20 століття в гістології найбільш посилено стали розвиватися еволюційні підходи, що грунтувалися на роботах Дарвіна і Геккеля. Завдяки роботам ембріологів Вольфа, Нанлсра, Мечникова і Ковалевського, були продовжені пошуки у сфері ембріології і підтримані еволюційні підходи.

. Сучасний етап розвитку гістології почався з 1950 р, коли вперше електронний мікроскоп був застосований для вивчення біологічних об'єктів. Однак для сучасного етапу розвитку гістології характерно впровадження не тільки електронної мікроскопії, а й інших методів: цито- і гистохимии, гісторадіографіі і т. д. При цьому зазвичай використовується комплекс різних методів, що дозволяють скласти не тільки якісне уявлення про досліджуваних структурах, але й отримати тонкі кількісні характеристики. Особливо широко в даний час застосовуються різні морфометричні методи, в тому числі і автоматизована обробка отриманої інформації з використанням персонального комп'ютера.

2. Предмет, завдання і проблеми гістології

Гістологія (. Від грец histos - тканина, логотипи - вчення) - наука про будову, розвиток і життєдіяльность тканин тварин організмів. Гістологія разом з іншими фундаментальними медико-біологічними науками вивчає закономірності структурної організації живої матерії.

Предметом гістології є саме тканини, що представляють собою систему наступної за клітинним рівнем організації живої матерії в цілісному організмі. Тканинам властиві загальнобіологічні закономірності, властиві живій матерії, і разом з тим власні особливості будови, розвитку, життєдіяльності, внутрішньотканинному і міжтканинному зв'язку. Тканини служать елементами розвитку, будови і життєдіяльності органів і їх морфофункціональних одиниць. Тканини являють собою систему клітин і неклітинних структур, що об'єдналися і спеціалізувалися в процесі еволюції для виконання найважливіших функцій в організмі. Для кожної з 5 основних тканинних систем (нервова тканина, м'язова тканина, епітеліальна тканина, сполучна тканина, кров) характерні властиві саме їм особливості будови, розвитку і життєдіяльності. Предметом загальної гістології, або власне вчення про тканини, є загальні закономірності, характерні для тканинного рівня організації та відмінні риси конкретних тканин; предметом приватної гістології - закономірності будови, життєдіяльності і взаємодії різних тканин в органах на більш високих рівнях організації. Приватна гістологія служить основою для вивчення мікроскопічної будови морфофункціональних одиниць органів та органів в цілому.

Гістологія включає в себе також цитологію - вчення про клітині і ембріологію - вчення про зародку. Ці самостійні в якійсь мірі курси передують загальної та приватної гістології. головне завдання - з'ясування структурної організації процесів життєдіяльності та в зв'язку з цим - можливості цілеспрямованого впливу на них. Вивчення кожної структури повинно проводитися з історичних позицій, що грунтуються на еволюційному вченні Ч. Дарвіна, згідно з яким всі складові частини людського організму розглядаються як результат філогенетичного розвитку. Теорії розвитку тканин (паралельних рядів А. А. Заварзіна і дивергентного розвитку Н. Г. Хлопіна) встановлюють основні закономірності формування тканин в філогенезі. Для пізнання закономірностей розвитку, будови, обміну та функції клітин, тканин і органів у сучасній гістології широко застосовуються експериментальні методи дослідження, що дозволяють вести спостереження на живих об'єктах, моделювати різні процеси. Вивчення мікроструктур ведеться на молекулярному, субклітинному, клітинному і тканинному рівнях за допомогою мікроскопування в різних системах світлооптичних і електронних мікроскопів, методів цито- і гистохимии, авторадіографії, біометрії. Кількісний аналіз структур включає застосування математичного моделювання, ЕОМ, спеціалізованих автоматичних пристроїв.

Сучасні гістологія, цитологія та ембріологія вносять істотний внесок у розробку теоретичних і прикладних аспектів сучасної медицини та біології.

До фундаментальних теоретичних проблем відносяться:

Вивчення закономірностей цито- і гистогенеза, будови і функції клітин і тканин;

Вивчення закономірностей диференціювання і регенерації тканин;

З'ясування ролі нервової, ендокринної, імунної систем організму в регуляції процесів морфогенезу клітин, тканин і органів та їх функціонування;

Дослідження вікових змін клітин, тканин, органів;

Дослідження адаптації клітин, тканин і органів до дії різних біологічних, фізичних, хімічних та інших факторів;

Вивчення процесів морфогенезу в системі мати - плід;

Дослідження особливостей ембріогенезу людини.

Актуальними прикладними проблемами є дослідження клітинної та тканинної сумісності при переливанні крові, трансплантації тканин, при дії стресових факторів, вивчення регенераційних можливостей тканин в різних умовах, розробка морфологічних тестів для оцінки вікових змін, цітодіагностікі та ін.

Завдання гістології:

·вивчення структур на системному, організменному, клітинному і молекулярному рівнях;

·вивчення фізіології структур усіх рівнів;

·вивчення закономірностей диференціювання і регенерації;

·вивчення вікових особливостей тканин і клітинних структур, включаючи закономірності ембріогенезу;

·вивчення закономірностей адаптації структур усіх рівнів, в першу чергу пов'язаних з проблемами екології;

·вивчення закономірності нервової, ендокринної, імунної регуляції.

3. Методи гістологічних досліджень

.1 Об'єкти досліджень

Головними етапами цитологічного і гістологічного аналізу є вибір об'єкта дослідження, підготовка його для вивчення в мікроскопі, застосування методів микроскопирования, якісний і кількісний аналіз зображень.

Об'єктами дослідження служать живі і фіксовані клітини і тканини, їх зображення, отримані в світлових і електронних мікроскопах або на телевізійному екрані дисплея. Існує ряд методів, що дозволяють проводити аналіз зазначених об'єктів.

3.2 Світлова мікроскопія

Для вивчення гістологічних мікрооб'єктів застосовують звичайні світлові мікроскопи та їх різновиди, в яких використовуються джерела світла різними довжинами хвиль. У звичайних світлових мікроскопах джерело освітлення служить природний або штучний світло (рис. 1, А). Мінімальна довжин хвилі видимої частини спектра дорівнює приблизно 0,4 мкм. Отже, для звичайного світлового мікроскопа найменше разрешаемое відстань дорівнює приблизно 0,2 мкм (DO = '/ 2-0,4 мкм = 0,2 мкм), а загальне збільшення (твір збільшення об'єктива на збільшення окуляра) може бути 1500-2500. Таким чином, в світловому мікроскопі можна бачити не тільки окремі клітини розміром від 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры -органеллы, включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание 10.

Ультрафіолетова мікроскопія. Це різновид світлової мікроскопії. В ультрафіолетовому мікроскопі використовують більш короткі ультрафіолетові промені з довжиною хвилі близько 0,2 мкм. Разрешаемое відстань тут в 2 рази менше, ніж у звичайних світлових мікроскопах, і становить приблизно 0,1 мкм (DO = 72- 0,2 мкм = 0,1 мкм). Отримане в ультрафіолетових променях невидиме оком зображення перетвориться у видиме за допомогою реєстрації на фотопластинці або шляхом застосування спеціальних пристроїв (люмінесцентний екран, електронно-оптичний перетворювач). Флуоресцентна (люмінесцентна) мікроскопія. Явища флюоресценції полягають в тому, що атоми і молекули ряду речовин, поглинаючи короткохвильові промені, переходять в збуджений стан. Зворотний перехід із збудженого стану в нормальний відбувається з випусканням світла, але з більшою довжиною хвилі. У флуоресцентної мікроскопії в якості джерел світла для порушення флюоресценції застосовують ртутні або ксенонові лампи надвисокого тиску, що володіють високою яскравістю в області спектра 0,25-0,4 мкм (ближні ультрафіолетові промені) і 0,4-0,5 мкм (синьо-фіолетові промені). Довжина світлової хвилі флюоресценції завжди більше довжини хвилі збуджуючого світла, тому їх поділяють за допомогою світлофільтрів і вивчають зображення об'єкта тільки в світлі флюоресценції. Розрізняють власну, або первинну, і наведену, або вторинну, флюоресценцію. Будь-яка клітина живого організму володіє власною флюоресценцией, проте вона часто буває надзвичайно слабкою. Первинної флюоресценцией володіють серотонін, катехоламіни (адреналін, норадреналін), що містяться в нервових, здорових та інших клітинах, після фіксації тканин в парах формальдегіду при 60-80 ° С (метод Фалька). Вторинна флюоресценція виникає при обробці препаратів спеціальними барвниками - флюорохромами. Існують різні флюорохромами, які специфічно зв'язуються з певними макромолекулами (акридин помаранчевий, родамін, флюоресцеин та ін.). Наприклад, при обробці препаратів найчастіше вживається флюорохром акридіновий помаранчевий. У цьому випадку ДНК та її сполуки в клітинах мають яскраво-зелене, а РНК та її похідні - яскраво-червоне свічення. Таким чином, спектральний склад випромінювання несе інформацію про внутрішню будову об'єкта та його хімічному складі. Варіант методу флуоресцентної мікроскопії, при якому і збудження, і випромінювання флюоресценції відбуваються в ультрафіолетовій області спектра, отримав назву методу ультрафіолетової флуоресцентної мікроскопії. Фазовоконтрастной мікроскопія. Цей метод служити для Отримання контрастних збережених прозорих и безбарвних живих об'єктів, невидимих при звичайних методах микроскопирования. Як уже позначають, у звічайній світловій мікроскопі необхідна контрастність структур досягається за помощью фарбування. Метод фазового контрасту Забезпечує контрастність досліджуваних нефарбованих структур за рахунок спеціальної кільцевої діафрагми, что поміщається в конденсорі, и так званої фазової пластинки, что находится в об'єктіві. Така конструкція оптики мікроскопа дає можлівість перетворити які не сприймаються оком фазові. Зміни пройшли через незабарвлений препарат світла в зміні його амплітуді, тобто яскравості одержуваного зображення. Підвищення контрасту дозволяє бачити всі структури, что розрізняються за Показники заломлених. Різновідом методу фазового контрасту є метод фазово- темнопольного контрасту, что дает негативний порівняно з позитивним фазового контрасту зображення.

Мікроскопія в темному полі. У темнопольному мікроскопі тільки світло, який дає дифракцію структур в препараті, досягає об'єктива. Відбувається це завдяки наявності в мікроскопі спеціального конденсора, який висвітлює препарат суворо косим світлом; промені від освітлювача направляються збоку. Таким чином, поле виглядає темним, а дрібні частинки в препараті відбивають світло, який далі потрапляє в об'єктив. Дозвіл цього мікроскопа не може бути краще, ніж у світлопольного мікроскопа, так як використовується така ж довжина хвилі. Але тут досягається більший контраст. Він використовується для вивчення живих об'єктів, авторадіографічних об'єктів, наприклад зерен срібла, які виглядають світлими на темному полі. У клініці його застосовують для вивчення кристалів в сечі (сечова кислота, оксалати), для демонстрації спірохет, зокрема бліда спірохета, що викликає сифіліс тощо. Інтерференційна мікроскопія. Різновидами фазово-контрастного мікроскопа є інтерференційний мікроскоп, який призначений для кількісного визначення маси тканини, і диференційний інтерференційний мікроскоп (з оптикою Номарського), який спеціально використовують для вивчення рельєфу поверхні клітин та інших біологічних об'єктів.

У інтерференційному мікроскопі пучок світла від освітлювача розділяється на два потоки: один проходить через об'єкт і змінює по фазі коливання, другою йде, минаючи об'єкт. У призмах об'єктива обидва пучка з'єднуються і інтерферують між собою. В результаті будується зображення, в якому ділянки мікрооб'єкту різної товщини і щільності розрізняються за ступенем контрастності. Провівши кількісну оцінку змін, визначають концентрацію і масу сухої речовини.

Фазово-контрастний і інтерференційний мікроскопи дозволяють вивчати живі клітини. У них використовується ефект інтерференції, що виникає при комбінації двох наборів хвиль, який створює зображення мікроструктур. Перевагою фазово-контрастної, інтерференційної і темнопольної мікроскопії є можливість спостерігати клітини в процесі руху і мітозу. При цьому реєстрація руху клітин може проводитися за допомогою цейтраферний (покадровой) мікрокінозйомок.

Поляризаційна мікроскопія. Поляризаційний мікроскоп є модифікацією світлового мікроскопа, в якому встановлені два поляризаційних фільтра - перший (поляризатор) між пучком світла, і об'єктом, а другий (аналізатор) між лінзою об'єктива і оком. Через перший фільтр світло проходить тільки в одному напрямку, другий фільтр має головну вісь, яка розташовується перпендикулярно першому фільтру, і він не пропускає світло. Виходить ефект темного поля. Обидва фільтра можуть обертатися, змінюючи напрямок пучка світла. Якщо аналізатор повернути на 90 ° по відношенню до поляризатора, то світло проходити через них не буде. Структури, що містять поздовжньо орієнтовані молекули (колаген, мікротрубочки, мікрофіламенти), і кристалічні структури (в клітинах Лейдіга1) при зміні осі обертання проявляються як світяться. Здатність кристалів або паракрісталліческіх утворень до роздвоєння світлової хвилі на звичайну і перпендикулярну до неї називається подвійне променезаломлення. Такий здатністю мають фібрили поперечносмугастих м'язів.

3.3 Електронна мікроскопія

Великим кроком вперед у розвитку техніки мікроскопії були створення і застосування електронного мікроскопа (див. Рис. 1, Б). В електронному мікроскопі використовується потік електронів з більш короткими, ніж в світловому мікроскопі, довжинами хвиль. При напрузі 50 000 В довжина хвилі електромагнітних коливань, що виникають при русі потоку електронів у вакуумі, дорівнює 0,0056 нм. Теоретично розраховано, що разрешаемое відстань в цих умовах може бути близько 0002 нм, або 0,000002 мкм, тобто в 100 000 разів менше, ніж в світловому мікроскопі. Практично в сучасних електронних мікроскопах разрешаемое відстань складає близько 0,1-0,7 нм.Таким образом, методы замораживания - скалывания и замораживания - травления позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов, вызываемых фиксацией. Методи контрастування солями важких металів дозволяють досліджувати в електронному мікроскопі окремі макромолекули - ДНК, великих білків (наприклад, міозин). При негативному контрастуванні вивчають агрегати макромолекул (рибосоми, віруси) або білкові філаменти (Актинові нитки).

Електронна мікроскопія ультратонких зрізів, отриманих методом кріоультрамікротоміі. При цьому методі шматочки тканин без фіксації і заливки в тверді середовища швидко охолоджують в рідкому азоті при температурі -196 ° С. Це забезпечує гальмування метаболічних процесів клітин і перехід води з рідкої фази в тверду. Далі блоки ріжуть на ультрамікротоме при низькій температурі. Такий метод приготування зрізів зазвичай використовують для визначення активності ферментів, а також для проведення імунохімічних реакцій. Для виявлення антигенів застосовують антитіла, пов'язані з частками колоїдного золота, локалізацію якого легко виявити на препаратах.

Методи сверхвисоковольтной мікроскопії. Використовують електронні мікроскопи з прискорює напругою до 3000 тисяч В. Перевага цих мікроскопів в тому, що вони дозволяють досліджувати об'єкти великої товщини-10 мкм), тому що при високій енергії електронів вони менше поглинаються об'єктом. Стереоскопічна зйомка дозволяє отримувати інформацію про тривимірної організації внутрішньоклітинних структур з високою роздільною здатністю (близько 0,5 нм).

Рентгеноструктурний аналіз. Для вивчення структури макромолекул на атомарному рівні застосовують методи з використанням рентгенівських променів, що мають довжину хвилі близько 0,1 нм (діаметр атома водню). Молекули, що утворять кристалічну решітку, вивчають за допомогою дифракційних картин, які реєструють на фотопластинці у вигляді безлічі плям різної інтенсивності. Інтенсивність плям залежить від здатності різних об'єктів в решітці розсіювати випромінювання. Положення плям в дифракційної картині залежить від положення об'єкта в системі, а їх інтенсивність свідчить про його внутрішню атомної структурі.

.4 Методи дослідження фіксованих клітин і тканин

Основним об'єктом дослідження є гістологічні препарати, приготовлені з фіксованих структур. Препарат може являти собою мазок (наприклад, мазок крові, кісткового мозку, слини, цереброспинальної рідини та ін.), Відбиток (наприклад, селезінки, тимуса, печінки), плівку з тканини (наприклад, сполучної або очеревини, плеври, м'якої мозкової оболонки) , тонкий зріз. Найбільш часто для вивчення використовується зріз тканини або органу. Гістологічні препарати можуть вивчатися без спеціальної обробки. Наприклад, приготований мазок крові, відбиток, плівка або зріз органу можуть відразу розглядатися під мікроскопом. Але внаслідок того, що структури мають слабкий контраст, вони погано виявляються в звичайному світловому мікроскопі і потрібне використання спеціальних мікроскопів (фазово-контрастні та ін.). Тому частіше застосовують спеціально оброблені препарати.

Процес виготовлення гістологічного препарату для світлової та електронної мікроскопії включає наступні основні етапи:

) взяття матеріалу і його фіксація;

) ущільнення матеріалу;

) приготування зрізів;

) фарбування або контрастування зрізів.

Для світлової мікроскопії необхідний ще один етап - укладання зрізів в бальзам або інші прозорі середовища Е). Фіксація забезпечує запобігання процесів розкладання, що сприяє збереженню цілісності структур. Це досягається тим, що взятий з органу маленький зразок або занурюють у фіксатор (спирт, формалін, розчини солей важких металів, осмієва кислота, спеціальні фіксуючі суміші), або піддають термічній обробці. Під дією фіксатора в тканинах і органах відбуваються складні фізико-хімічні зміни. Найбільш істотним з них є процес незворотної коагуляції білків, внаслідок якого життєдіяльність припиняється, а структури стають мертвими, фіксованими. Фіксація призводить до ущільнення та зменшення обсягу шматочків, а також до поліпшення наступного фарбування клітин і тканин. Ущільнення шматочків, необхідне для приготування зрізів, проводиться шляхом просочування попередньо зневодненого матеріалу парафіном, целлоідин, органічними смолами. Більш швидке ущільнення досягається застосуванням методу заморожування шматочків, наприклад в рідкій вуглекислоті. Приготування зрізів проводиться на спеціальних приладах - мікротомів (для світлової мікроскопії) і ультрамікротомах (для електронної мікроскопії).

Фарбування зрізів (у світлової мікроскопії) або напилення їх солями металів (в електронній мікроскопії) застосовують для збільшення контрастності зображення окремих структур при розгляданні їх в мікроскопі. Методи забарвлення гістологічних структур дуже різноманітні і вибираються залежно від завдань дослідження. Гістологічні барвники поділяють на кислі, основні і нейтральні. Як приклад можна привести найбільш відомий основний барвник АЗУР II, який забарвлює ядра у фіолетовий колір, і кислий барвник -еозін, що забарвлює цитоплазму в рожево-оранжевий колір. Виборче спорідненість структур до певних фарбникам обумовлено їх хімічним складом і фізичними властивостями. Структури, добре забарвлюються кислими барвниками, називаються Оксифільні (ацидофільними, еозинофільними), а окрашування основними - базофільними . Структури, що сприймають як кислі, так і основні барвники, є нейтрофільними (Гетерофільні). Пофарбовані препарати зазвичай зневоднюють в спиртах зростаючої фортеці і просвітлюють в ксилолі, бензолі, толуолі або деяких маслах. Для тривалого збереження зневоднений гістологічний зріз укладають між предметним і покривним склом в канадський бальзам або інші речовини. Готовий гістологічний препарат може бути використаний для вивчення під мікроскопом протягом багатьох років. Для електронної мікроскопії зрізи, отримані на ультрамікротоме, поміщають на спеціальні сітки, контрастують солями марганцю, кобальту та ін., Після чого переглядають у мікроскопі і фотографують. Отримані мікрофотографії служать об'єктом вивчення поряд з гістологічними препаратами.

.5 Методи дослідження живих клітин і тканин

Вивчення живих клітин і тканин дозволяє отримати найбільш повну інформацію про їх життєдіяльності - простежити рух, процеси ділення, руйнування, росту, диференціювання та взаємодії клітин, тривалість їх життєвого циклу, реактивні зміни у відповідь на дію різних факторів. Прижиттєві дослідження клітин в організмі (у природних умовах). Одним з прижиттєвих методів дослідження є спостереження структур в живому організмі. За допомогою спеціальних просвічують мікроскопів-ілюмінаторів, наприклад, можна вивчати в динаміці циркуляцію крові в мікросудинах. Після проведення анестезії у тварини об'єкт дослідження (наприклад, брижа кишечника) виводять назовні і розглядають в мікроскопі, при цьому тканини повинні постійно зволожувати фізіологічним розчином натрію хлориду. Однак тривалість такого спостереження обмежена. Кращі результати дає метод імплантації прозорих камер в організм тварини. Найбільш зручним органом для імплантації таких камер і подальшого спостереження є вухо якої-небудь тварини (наприклад, кролика). Ділянка вуха з прозорою камерою поміщають на предметний столик мікроскопа і в цих умовах вивчають динаміку зміни клітин і тканин протягом тривалого часу. Таким чином можуть вивчатися процеси виселення лейкоцитів з кровоносних судин, різні стадії освіти сполучної тканини, капілярів, нервів та інші процеси. В якості природної прозорою камери можна використовувати очей експериментальних тварин. Клітини, тканини або зразки органів поміщають в рідину передньої камери ока в кут, утворений рогівкою і райдужкою, і можуть спостерігатися через прозору рогівку. Таким чином була проведена трансплантація заплідненої яйцеклітини і простежено ранні стадії розвитку зародка. Мавпам були пересаджені невеликі шматочки матки і вивчені зміни слизової оболонки матки в різні фази менструального циклу.

Широке застосування знайшов метод трансплантації клітин крові і кісткового мозку від здорових тварин-донорів тваринам-реципієнтам, підданих смертельного опромінення. Тварини-реципієнти після трансплантації залишалися живими внаслідок приживлення донорських клітин, що утворюють в селезінці колонії кровотворних клітин. Дослідження числа колоній і їх клітинного складу дозволяє виявляти кількість родоначальних кровотворних клітин і різні стадії їх диференціювання. За допомогою методу колоніеобразованія встановлено джерела розвитку для всіх клітин крові.

Вітальне і Суправітальне фарбування. При вітальному (прижиттєвому) фарбуванні клітин і тканин барвник вводять в організм тварини, при цьому він вибірково забарвлює певні клітини, їх органели або міжклітинний речовина. Наприклад, за допомогою трипанового синього або літієвого карміну виявляють фагоцити, а за допомогою алізарину - новостворений матрикс кістки. Суправітально фарбуванням називають фарбування живих клітин, виділених з організму. Таким способом виявляють молоді форми еритроцитів - ретикулоцити крові (барвник діамантовий крезіловий блакитний), мітохондрії в клітинах (барвник зелений янус), лізосоми (барвник нейтральний червоний). Дослідження живих клітин і тканин в культурі (у пробірці). Цей метод є одним з найпоширеніших. Виділені з організму людини або тварин клітини, маленькі зразки тканин чи органів поміщають у скляні або пластмасові посудини, що містять спеціальну живильне середовище, - плазму крові, ембріональний екстракт, а також штучні середовища. Розрізняють суспензійні культури (клітини зважені в середовищі), тканинні, органні і моношарова культури (експлантірованние клітини утворюють на склі суцільний шар). Забезпечуються стерильність середовища і температура, відповідна температурі тіла. У цих умовах клітини протягом тривалого часу зберігають основні показники життєдіяльності - здатність до зростання, розмноження, диференціювання, руху. Такі культури можуть існувати багато дні, місяці і навіть роки, якщо оновлювати середу культивування і пересаджувати життєздатні клітини в інші судини. Деякі види клітин завдяки змінам в їх геномі можуть зберігатися і розмножуватися в культурі, утворюючи безперервні клітинні лінії. У розробку методів культивування клітин і тканин великий внесок внесли А. А. Максимов, А. В. Румянцев, Н. ГХлопін, А. Д. Тимофєєвський, Ф. М. Лазаренко. В даний час отримані клітинні лінії фібробластів, міоцитів, епітеліоцитів, макрофагів та ін., Які існують багато років.

Використання методу культивування дозволило виявити ряд закономірностей диференціювання, злоякісного переродження клітин, клітинних взаємодій, взаємодій клітин з вірусами і мікробами. Показана можливість хрящових клітин формувати в культурі міжклітинний речовина і здатність клітин наднирників продукувати гормони. Культивування ембріональних тканин і органів дало можливість простежити розвиток кістки, шкіри та інших органів. Розроблено методику культивування нервових клітин. Особливу значущість метод культури тканин має для проведення експериментальних спостережень на клітинах і тканинах людини. Взяті з організму людини клітини при пункції або біопсії можуть в культурі тканин використовуватися для визначення статі, спадкових захворювань, злоякісного переродження, виявлення дії низки токсичних речовин. В останні роки клітинні культури широко застосовуються для гібридизації клітин. Розроблено методи розділення тканин на клітини, виділення окремих типів клітин та їх культивування. Спочатку тканину перетворюють на суспензію клітин шляхом руйнування міжклітинних контактів і міжклітинного матриксу за допомогою протеолітичних ферментів (трипсин, коллагеназа) і з'єднань, що зв'язують Са2 + .Далі отриману суспензію поділяють на фракції клітин різних типів за допомогою центрифугування, що дозволяє відокремити важчі клітини від легких, великі від малих, або шляхом прилипання клітин до скла або пластмасі, здатність до якого у різних типів клітин неоднакова. Для забезпечення специфічного прилипання клітин до поверхні скла використовують антитіла, специфічно зв'язуються з клітинами одного типу. Прилиплі клітини потім відділяють, руйнуючи матрикс ферментами, при цьому отримують суспензію однорідних клітин. Більш тонким методом поділу клітин є мічення антитілами, пов'язаними з флюоресцирующими барвниками. Мічені клітини відокремлюються від немічених за допомогою сортера (електронного флюоресцентної-активируемого клітинного аналізатора). Клітинний аналізатор сортує в 1 з близько 5000 клітин. Виділені клітини можна вивчати в умовах культивування. Метод культивування клітин дозволяє вивчати їх життєдіяльність, розмноження, диференціювання, взаємодія з іншими клітинами, вплив гормонів, факторів росту та ін. Культури зазвичай готують із суспензії клітин, отриманої вищеописаним методом дисоціації тканини. Більшість клітин нездатні рости в суспензії, їм необхідна тверда поверхня, в якості якої використовують поверхню пластикової культуральной чашки, іноді з компонентами позаклітинного матриксу, наприклад колагену. Первинними культурами називають культури, приготовані безпосередньо після першого етапу фракціонування клітин, вторинними - культури клітин, пересаджені з первинних культур в нове середовище. Можна послідовно перевіваемих клітини протягом тижнів і місяців, при цьому клітини зберігають характерні для них ознаки диференціювання (наприклад, клітини епітелію утворюють шари). Вихідним матеріалом для клітинних культур зазвичай служать ембріональні тканини і тканини новонароджених. В якості поживних середовищ використовують суміші солей, амінокислот, вітамінів, кінської сироватки, екстракт курячих ембріонів, ембріональну сироватку та ін. В даний час розроблені спеціальні середовища для культивування різних типів клітин. Вони містять один або кілька білкових факторовроста, необхідних клітинам для життєдіяльності та розмноження. Наприклад, для зростання нервових клітин необхідний фактор росту нервів (ФРН).

Іноді в культурі з'являються мутантні клітини, які розмножуються нескінченно і утворюють клітинну лінію (фібробласти, епітеліоцити, міобласти та ін.). Мутантні клітини відрізняються від ракових клітин, також здатних до безперервного поділу, але які можуть рости без прикріплення до твердої поверхні. Ракові клітини в культуральних чашках утворюють більш щільну популяцію, ніж популяції звичайних клітин. Аналогічне властивість можна викликати експериментально у нормальних клітин шляхом трансформації їх опухолеродного вірусами або хімічними сполуками, при цьому утворюються неопластичними трансформовані клітинні лінії. Клітинні лінії нетрансформованих і трансформованих клітин можна довго зберігати при низьких температурах (-70 ° С). Генетичну однорідність клітин посилюють клонуванням, коли з однієї клітини при її послідовному розподілі отримують велику колонію однорідних клітин.

4. Приготування гістологічного матеріалу

4.1 Зрізи

Для отримання гістологічних зрізів застосовують спеціальні мікротомні ножі, що розрізняються за формою, довжіні и куту перетин леза. За формою смороду являютя собою складаний сталевий клин, у якого ріжучій край має Додатковий клиновидну заточку. Довжина ножа може становити від 8 до 50 см. За конфігурації леза розрізняють три групи мікротомних ножів: А, В і С. У мікротомних ножів, що відносяться до групи А, одна поверхня рівна, а Інша увігнута (їх називають плоско-увігнутими з великою кривизною увігнутою поверхні). ЦІ ножі найчастіше виготовлені з м'якої або відносно м'якої Сталі и прізначені для Різання об'єктів, залитих в целлоидин. Ножі, Які відносяться до групи В, назіваються плоско-увігнутімі, но кривизна увігнутій поверхні у них значний менше, чем у ножів групи А. Смороду віготовлені з більш твердої Сталі, Використовують їх для Приготування целлоідіновіх и целлоидин-парафіновіх зрізів. У ножів, что відносяться до групи С, обідві поверхні клинка плоскі. Їх виготовляють з твердої Сталі и застосовують для Різання об'єктів, залитих в парафін, а такоже для Отримання зрізів на заморожують мікротому. Крім того, для Приготування парафіновіх и напівтонку зрізів на мікротомі и ультратомах Використовують металеві магнітні леза и скляні ножі. Металеве магнітне лезо (одноразові чем) дозволяє отріматі зрізі з 50 - 60 парафіновіх блоків, потім лезо міняють.

.2 Фарбування гістологічних препаратів

В Основі фарбування клітін и тканин лежати фізико-хімічні процеси (дифузія, адсорбція, абсорбція, розчінність та ін.), Що відбуваються як в барвники, так и в мікроструктурах. Велике значення мают щільність тканини и дісперсність барвники, Які візначають послідовність и ШВИДКІСТЬ фарбування.

Метою фарбування є більш виразности Виявлення різніх компонентів клітін и тканин. Деякі барвники забезпечують цею ефект, розчіняючісь в віявляються компонентах, Наприклад нейтральних жирах. Інші барвники віклікають хімічну реакцію, Наприклад Виявлення заліза з Утворення берлінської блакиті в кислому середовіщі. У багатьох випадка процес фарбування можливий Тільки при наявності протрави, Наприклад гематоксилин забарвлює тканини в прісутності солей металів. У гістологічної практиці застосовують основні, кислотні і нейтральні барвники. Основні, або ядерні, барвники - це підстави або їх солі, які забарвлюють структури кислої природи (хроматин ядер, ядерце та ін.) І називаються базофільними. До них відносяться гематоксилин, тіонін, кармін, метиловий зелений та ін. Кислотні барвники - це кислоти або їх солі, за допомогою яких виявляють речовини і структури основної природи (цитоплазматические структури клітин, еритроцити і т.д.). Такими є еозин, кислий фуксин, конго червоний (конгорот), еритрозин. Нейтральні барвники: судан III, судан IV, метиленовий синій. Процес гістологічного фарбування умовно поділяють на прогресивний і регресивний, прямий і непрямий, простий і складний. При прогресивному типі фарбування процес іде до тих пір, поки не досягається інтенсивне проникнення барвника в тканину. Регресивний тип заснований на первинному перефарбування структур з наступною дифференцировкой до потрібного рівня. Якщо розчин барвника безпосередньо діє на тканину, то говорять про пряме фарбуванні. Фарбування після попередньої підготовки тканини (протруювання) називається непрямим. Фарбування одним барвником - просте, а при використанні декількох барвників - складне.

4.3 Просвітлення і висновок зрізів

Одним з основних умов, що визначають придатність гістологічних препаратів до мікроскопічному дослідженню, є їх прозорість. Крім того, препарати повинні бути захищені від висихання і забруднення. Все це забезпечується просвітленням та укладенням у спеціальні середовища, які можна поділити на змішуються з водою (гліцерин, гуміарабік, полівініловий спирт, желатин) і не змішуються з водою (ксилол, толуол, їх суміші з фенолом, ефірні масла). Змішуються з водою просвітлюючі речовини одночасно є середовищем для укладення та приготування постійних препаратів. З цих середовищ частіше застосовують гліцерин-желатин. Використовують також чистий гліцерин, однак цей метод не дозволяє готувати постійні препарати. Середовища, змішуються з водою (крім гліцерину), попередньо нагрівають на водяній бані, капають нагрітої скляною паличкою або піпеткою на розправлені зріз, злегка підсушують і покривають чистим і сухим покривним склом. Чистої скляною паличкою або знежиреним пальцем злегка притискають покривне скло. При цьому надлишки середовища видавлюються і їх акуратно видаляють чистою тканиною. Для тривалого зберігання препаратів, щоб уникнути їх висихання, багато авторів рекомендують обкантовувати покривне скло тонким шаром парафіну або целлоідин. Проте досвід показує, що ув'язнені в гліцерин-желатин препарати і без окантовки добре зберігаються понад 10 років.

5. Взяття і фіксація гістологічного матеріалу

Найважливішими умовами отримання високоякісних гістологічних препаратів є можливо більш раннє отримання матеріалу, мінімальне травмування тканини і адекватна фіксація. Ці умови відносно просто здійснимі при роботі з біопсійного, операційним і експериментальним матеріалом, тоді як при секційному дослідженні часто спостерігаються явища аутолізу.

.1 Техніка вирізки матеріалу

Оптимальна площа шматочків тканини 2 - 3 см2, товщина 5 - 7 мм. Вирізані шматочки тканини безпосередньо з леза ножа занурюють у фіксатор і змочують в холодному фізіологічному розчині хлориду натрію, що дозволяє уникнути висихання матеріалу. Неприпустимі здавлювання шматочків, промивання їх водою, а також очищення поверхні органу, особливо слизової оболонки, інструментами, пальцями і т.д. Після занурення шматочків в посудину з фіксатором туди ж опускають етикетку з номером (шифром), написаним олівцем або тушшю на матової поверхні фотопаперу. У тих випадках, коли виникає необхідність маркування кожного шматочка, його разом з етикеткою зав'язують в марлевий мішечок. Можливо також нанизування шматочків на нитку: спочатку 2 - 3 рази прошивають етикетку першого шматочка, потім сам шматочок, потім наступну етикетку і так далі до 10-15 шматочків. При наявності патологічно змінених ділянок тканин і органів шматочки вирізують на кордоні з нормальною тканиною. Шматочки порожнистих органів вирізують таким чином, щоб у препараті було видно всі шари стінки. Для вивчення стінки судини на великому протязі його розрізають уздовж, згортають у вигляді рулону і прошивають посередині. Шматочки стінки порожнього органа зручно попередньо розпластується на фотопапері. Для дослідження пухкої сполучної тканини готують плівчасті препарати: після обережної препаровки соединительнотканную плівку натягують пінцетом на знежирене предметне скло і фіксують.

.2 Техніка фіксації матеріалу

Фіксація забезпечує стабілізацію тканинних структур та їх ущільнення. Механізм дії фіксаторів заснований на коагуляції білків і стабілізації ліпідів. Фіксація завжди призводить до великих або менших змін структури і об'єму тканини, ступінь вираженості яких залежить від рН фіксатора, його концентрації, температури, тривалості впливу та інших факторів. Концентрація іонів водню фіксатора повинна відповідати такої в тканинах, тому фіксатор повинен мати рН, близьке до нейтрального. Збільшення температури фіксатора прискорює процес, але викликає ще більші зміни в тканинах. Дуже тривала фіксація приводить до значного ущільнення матеріалу, що надалі утрудняє його обробку. Для кожного конкретного виду дослідження підбирають найбільш прийнятний фіксатор.

Повноцінна фіксація матеріалу забезпечується при дотриманні ряду вимог.

. Після вирізки шматочка тканини його негайно занурюють у фіксатор.

. Обсяг фіксатора повинен перевищувати обсяг фіксованої матеріалу в 10 - 20 разів, так як тканинна рідина може істотно змінити концентрацію фіксатора.

. У тому випадку, якщо колір фіксатора змінюється після занурення в нього шматочків тканини, фіксатор необхідно негайно змінити.

. Неприпустимо повторне використання фіксаторів.

. Для кожного фіксатора слід дотримуватися встановлений час фіксації. Тривале перебування матеріалу можливо лише в деяких фиксаторах, наприклад 10% нейтральному формаліні, рідини Буена. Для фіксації краще використовувати ємкості з широким горлом, щоб не виникло проблем з отриманням фіксованого матеріалу. Рівномірність фіксації деяких пухких тканин, наприклад легеневої, досягається приміщенням їх на дно банки, а поверх них - прокладки з шару марлі чи вати.

5.3 Прості фіксують рідини

Формалін. Основним, широко застосовуваним фіксатором служить формалін, що представляє собою 40% розчин формальдегіду. З нього готують нейтральний (забуферений до рН 7,0) 10-12% формалін. Для цього в банку з 40% формаліном засипають карбонат кальцію або магнію або суміш цих солей - доломіт з розрахунку 100 г на 1 л формаліну. Універсальним фіксатором, придатним для гістологічних та більшості гістохімічних досліджень, є нейтральний формалін по Ліллі. А. 100 мл 40% формаліну + 900 мл дистильованої води. Б. 4 г дигідроортофосфат натрію моногідрату (однозамещенного фосфату натрію) .В. 6,5 г гідроортофосфат натрію (двузамещенного фосфату натрію). Етиловий спирт (80%, 90%, 96% і 100%). Його застосовують як фіксатор для виявлення глікогену, заліза, амілоїду, але він розчиняє ліпіди. Механізм дії заснований на осадженні білків, при цьому відбувається зневоднення об'єктів, що значно прискорює проводку. Тривалість фіксації від 2 год до 1 сут. Збільшення тривалості фіксації, особливо в 100% спірте1, небажано, тому що матеріал значно ущільнюється і відбувається його пересушування. Оптимальна температура для фіксації матеріалу в спирті +4 ° С, але її можна проводити і при кімнатній температурі. Ацетон (його дія подібна до дії спирту). Ацетон використовують для збільшення швидкості фіксації. Застосовують 100% ацетон, для отримання якого в комерційний ацетон засипають прожарений сульфат міді (мідний купорос) або сілікатель. В ацетоні фіксують шматочки товщиною 3 - 4 мм протягом 2 год при 20 ° С або 30 хв- 1 год в термостаті при 60 ° С. Сулема (дихлорид ртуті). Сулему застосовують як фіксатор з початку розвитку гістології. Готують насичений розчин: 10 г сулеми на 100 мл дистильованої води або ізотонічного розчину хлориду натрію доводять до кипіння, охолоджують, фільтрують. Тривалість фіксації шматочків товщиною 3 мм 6-12 год при 20 ° С. При фіксації сулемою можлива поява в тканинах кристалічного осаду, який видаляють шляхом обробки зрізів йодованим 70% спиртом.

Висновок

Гістологія вивчає не тільки тканини, але й клітини, з яких вони складаються, будову органів і систем організму. Згідно з цим існують такі розділи предмету, як цитологія (наука про клітину), загальна гістологія, або власне гістологія (вивчає тканини), спеціальна гістологія (вивчає будову органів і їх систем). Тісно пов'язана з гістологією також наука про розвиток зародка - ембріологія, тому що структури організму вивчаються у процесі їхнього виникнення і розвитку. Ембріологія як і цитологія нині відокремилися від гістології і є самостійними науками, але в навчальному курсі медичного інституту вони об'єднані в один предмет разом з гістологією. Таким чином, повна назва курсу - гістологія з цитологією та ембріологією.

Предмет гістології - тонка (мікроскопічна) та ультратонка (субмікроскопічна) будова структур організму, яка вивчається методом мікроскопії. Тонкими або мікроскопічними структурами називають такі, що не видні неозброєним оком, а лише під світловим мікроскопом. Ультратонкі або субмікроскопічні структури можна побачити під електронним мікроскопом. Мікроскопічний метод відрізняє гістологію від анатомії, яка теж вивчає будову організму, але на рівні того, що можна бачити неозброєним оком. Ці дві науки, а також топографічну та патологічну анатомії називають морфологічними (від грецького "морфос" - форма, що означає вивчення форми, тобто будови організму). Отож, можна сказати, що гістологія - це наука про мікроскопічну будову, розвиток і життєдіяльність структур організму. (Порівняємо з анатомією - це макроскопічна морфологія, а гістологія - це мікроскопічна морфологія).

Гістологія як біологічна наука тісно пов'язана з рядом інших біологічних дисциплін і зокрема, крім вже згаданої анатомії, з фізіологією та біохімією. Ці чотири дисципліни є фундаментом медичної освіти. Гістологія безпосередньо контактує, у першу чергу, з курсом патологічної анатомії, успішне вивчення якого можливе лише при твердих знаннях про будову нормальних, патологічно незмінених структур. Крім того, гістологія створює необхідну базу також для вивчення ряду клінічних дисциплін - терапії, хірургії, акушерства та гінекології, офтальмології, оториноларингології, дерматології та інших.

Гістологічна наука має велику історію, багату іменами та фактами, для самого переліку яких треба було б присвятити цілий розділ. Але таке перечислення мало що дасть студентові, який тільки починає знайомство з предметом. У зв'язку з цим, історичні посилання, подані у відповідних розділах, І, таким чином, віддано шану тим вченим, які вписали свої імена в гістологічну науку.

Список використаної літератури

1.Белецкий В.К. "Техника микроскопического исследования" Руководство по неврологии - М * Медгиз, 1942 - Т. 2.

.Елисеева В.Г., "Основы гистологии и гистохимической техники", Москва:Медицина, 1967

.Волкова О.В., Елецкий Ю.К., "Основы гистологии и гистологической техникой", Москва:Медицина,1971Хэм А., Кормак Д. "Гистология", тт. 1-5. М., 1982-1983.

.Втюрин Б.В., Палъцын А.А. "Современные методы и приемы электронно-микроскопических исследований биологических объектов (электронно-микроскопическая радиоавтография и растровая электронная микроскопия)" - М.Радио и связь, 1985.

.Бухвалов И.Б "Гистохимия" - Учебное пособие - М.* Высшая школа, 1993.

.Саркисов Д.С., Перов Ю.Л, "Микроскопическая техника", Москва "Медицина"1996.

.Юшканцева С.И., Быков В.Л., "Гистология, цитология и эмбриология",2006.

.Кузнецов С.Л., "Гистология,цитология и эмбриология", 2007.

.Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А., Котовский Е.Ф., "Гистология",2010.

.М.Л.Калайда, М.В.Нигметзянова, С.Д.Борисова, -учебное пособие "Общая гистология и эмбриология рыб"-СПБ: Проспект Науки,2011.

.http://www.morphology.dp.ua/_mp3/intro.php