Вакцинация и иммунопрофилактика инфекционных болезней

1 ВВЕДЕНИЕ

В конце ХХ века нет необходимости обсуждать значение иммунопрофилактики инфекционных болезней, эффективность иммунопрофилактики наглядно продемонстрирована десятками лет ее практического применения. Хорошо известно, что вакцинопрофилактика является ведущим фактором уменьшения заболеваемости, ослабления тяжести клинического течения и снижение смертности заболевших, уменьшение числа осложнений у перенесших инфекционные заболевания. Такие крупнейшие достижения медицины, как ликвидация оспы в мире, значительное сокращение заболеваемости полиомиелитом (которое позволило поставить вопрос о его ликвидации), дифтерией, корью стали возможными только благодаря тому, что были созданы эффективные вакцинные препараты против возбудителей этих инфекций. Их применение в широких масштабах позволило защитить людей от заражения, создавать невосприимчивость организма человека к инфекционному агенту. Широкая иммунизация детей дифтерийным анатоксином создала условия для практической ликвидации дифтерии во многих европейских странах в 70-е годы. К 1990 году число стран, в которых дифтерия не регистрировалась, достигло 81%. (33, 73). Эффективность вакцинопрофилактики позволила Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) поставить задачу - к 2000 году ликвидировать местные случаи полиомиелита, дифтерии, столбняка новорожденных и ряда других инфекций в европейском регионе.

Однако, резкое ухудшение эпидемиологической обстановки по дифтерии в России, на Украине и в Белорусии с 1990 года, с развитием тяжелых и даже летальных случаев заболеваний у невакцинированных поставило вопрос о необходимости неослабного контроля за проведением иммунизации детского населения и за состоянием иммунного статуса у взрослых с целью поддержания высокого уровня привитости.

Известно, что вакцины, полученные традиционными методами, вызывают ряд крайне нежелательных побочных эффектов, связанных с их реактогенностью и токсичностью. Используемые в повседневной практике вакцины - это малоконтролируемая сверхкомплексная смесь с огромным количеством балластных, в том числе высокотоксичных, загрязняющих компонентов из микробных клеток, питательной среды, из клеток, на которых выращиваются вирусы (клеточные культуры, куриные эмбрионы, эпидермис телят, мозг кролика и др.). Для создания иммунитета необходимы 1-2 антигенные детерминанты, а в организм вводится ряд сложнейших комплексов. Современная тенденция развития вакцинопрофилактики характеризуется получением вакцинных препаратов с химически определенным антигенным составом и регулируемой иммуногенностью. В связи с этим проблема создания вакцин нового поколения тесно связана с необходимостью получения высокоочищенных актуальных антигенов.

На современном этапе развития иммунологии и вакцинопрофилактики основным критерием при выборе антигена для вакцинации стало обеспечение возможности получения водоспецифического иммунитета, а также эффективной защиты от аэрогенного инфицирования. Препараты, созданные на основе белков наружной мембраны бактерий, и прежде всего поринов, могут защищать от инфекции, вызваемой всеми типами данного вида микроорганизма (Портнягина О.Ю. и соавт.2004).

Порообразующий белок Yersinia pseudotuberculosis обладает рядом иммунологических особенностей, позволяющих использовать его в вакцинных препаратах. Выбор термостабильной субъединичной формы порина в качестве антигена обусловлен его низкой гемолитической активностью, более выраженными иммунными свойствами по сравнению с его нативной тримерной формой. Однако, иммуногенность этого белка, в целом, не высокая, что делает необходимым применение для иммунизации этим антигеном усилителя иммуногенеза, такого как липид-сапониновой матрицы иммуностимулирующих комплексов (ИСКОМ) для повышения иммуноадъювантной активности бактериального антигена.

В работе поставлены задачи:

1. Разработка способа получения нового липид-сапонинового имуностимулирующего комплекса (ИСКОМ) на основе снижения токсических свойств и повышения его эффективности.
2. Разработка способа получения антиген-содержащих липид-сапониновых ТИ-комплексов.
3. Проведение их сравнительной оценки с известными адъювантными носителями.
4. Повышение эффективности вакцинации путем конструирования новых адъювантных систем на основе ТИ-комплексов и иммуномодуляторов.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

вакцинация иммуномодулятор инфекционный

2.1 Эффекторные механизмы иммунного ответа

Формирование иммунного ответа начинается со связывания антигена В- и Т-лимфоцитами, несущими мембранные белки-рецепторы, которые способны специфически распознавать отдельные участки - эпитопы (антигенные детерминанты чужеродных молекул). Иммуноглобулиновые рецепторы В-лимфоцитов (как и свободные антитела) распознают расположенные на поверхности участки антигена - так называемые В-эпитопы. Рецепторы Т-лимфоцитов взаимодействуют с пептидными фрагментами (Т-эпитопами) антигена, расщепленного в макрофаге. Т-эпитопы представлены на поверхности клетки, будучи нековалентно связанными с белками МНС (Major Hystocompatibility Complex, главный комплекс гистосовместимости). Комплексы МНС класса 1 связывают фрагменты белков, которые экспрессируются в самой клетке и расщепляются в протеосомах (собственные белки организма, белки вирусов, риккетсий и некоторых бактерий). Комплексы МНС класса 2 связывают фрагменты антигенов, захваченных антигенпрезентирующей клеткой по механизму эндоцитоза и подвергшихся протеолизу в эндолизосомальной системе. Рецепторы Т-клеток связываются с антигенными детерминантами, ассоциированными с МНС, поэтому специфичность этого связывания определяется не только структурой антигенного пептида, но и белками МНС. У человека эти белки получили название HLA (Human Leukocyte Antigens, антигены лейкоцитов человека). При взаимодействие Т-лимфоцита с клеткой, презентирующей антиген, происходит стимуляция лимфоцита, которая ведет либо к его гибели, либо к пролиферации соответствующего Т-клеточного клона.

Каждый из классов МНС кодируется группой локусов (генов), представленных множественными аллелями. Этот полиморфизм следует учитывать как при выявлении Т-эпитопов, так и при конструировании вакцин.

Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) инициируют запуск сложного каскада реакций, приводящих к гибели клеток, несущих соответствущие Т-эпитопы. Большая часть ЦТЛ клеток несет маркер клеточной мембраны CD8 и взаимодействует с МНС-1, чем и объясняется ключевая роль ЦТЛ в устранении клеток, пораженных внутриклеточной инфекцией.

Клетки, распознающие пептиды, ассоциированные с МНС-2 или Т-хелперы, несут маркер СD4. Они разделяются на подгруппы, отличающиеся по набору выделяемых ими цитокинов и, соответственно, различиями в каскаде запускаемых при взаимодействии с антигеном иммунорегуляторных механизмов. Считается, что клетки подтипа Т-хелперы1 принимают участие в стимуляции цитотоксических реакций, а клетки подтипа Т-хелперы2 стимулируют продукцию антител. Однако такое разделение не абсолютно.

Представления о механизмах Т-хелпер-стимуляции антителобразования укладывается в достаточно четкую схему. В-лимфоцит взаимодействует с поверхностным участком этого антигена (В-эпитопом) с помощью своего иммуноглобулинового рецептора. Связанный таким образом антиген подвергается интернализации и протеолизу с последующей презентацией полученных пептидов в составе МНС-2. Т-хелперы связываются с В-лимфоцитами, нисущими специфические Т-эпитопы процессированного антигена. Взаимодействие между Т-хелперами и В-клетками способствует запуску процессов пролиферации В-лимфоцитов. Часть размножающихся В-клеток дает начало плазматическим клеткам, синтезирующим антитела.

Часть Т- и В-лимфоцитов, пролиферирующих после стимуляции, дает начало клеткам памяти, которые обуславливают более быстрое развитие иммунных реакций при вторичном ответе на соответствующий антиген. На этом явлении и основана вакцинация. (Соболев Б.Н. и соавт. 2003).

2.2 Краткая история создания вакцин

Вакцинация самое известное и наиболее успешное применение иммунологических принципов в медицине. Первая вакцина была названа так по болезни крупного рогатого скота - vaccinia (коровья оспа), вызываемая, как выяснилось впоследствии, вирусом. Два столетия назад ее применил пионер исследований в этой области английский врач Э.Дженнер. Это стало первой научно продуманной попыткой предотвратить инфекционное заболевание человека (натуральную оспу).

Лишь столетие спустя Л.Пастером был сформулирован фундаментальный принцип вакцинации: для создания напряженного иммунитета против высоко вирулентных микроорганизмов можно применять препараты из тех же микроорганизмов, но с ослабленной путем определенного воздействия вирулентностью. Используя в соответствии с этим высушенный спинной мозг кролика зараженного вирусом бешенства, и прогретые культуры бацилл сибирской язвы, Пастер создал, по сути дела, прототипы современных вакцин. В то же время, созданная Э.Дженнером вакцина животного происхождения, содержащая вирус коровьей оспы (гетерологичная), не получила впоследствии как метод какого-либо продолжения. С появлением клонально-селекционной теории Ф.Бернета (1957) и данных о Т- и В-дифференциации лимфоцитов (1965) стал понятен ключевой механизм вакцинации: содержащийся в вакцине антиген должен вызывать клональную экспансию специфических Т- и (или) В-клеток, оставив после себя популяцию клеток иммунологической памяти. При следующей встрече с тем же антигеном именно они способны дать вторичный ответ, который обычно быстрее и эффективнее первичного (Ройт А. 2000).

2.3 Типы вакцин

Вакцинация приводит к формированию приобретенного иммунитета, а искусство создания вакцин заключается в разработке таких антигенных препаратов, которые:

• безвредны для организма
• вызывают нужную форму иммунного ответа и, кроме того,
• доступны по стоимости для населения.

Выбор типа антигенного препарата для применения в качестве вакцины зависит от многих факторов. Чем больше антигенов данного микроба останется в вакцине, тем выше ее иммуногенный потенциал, и живые микроорганизмы, как правило, эффективнее убитых. Исключение составляют болезни, патогенез которых определяется действием токсина. В этом случае основой вакцины может служить сам токсин. Еще одно исключение - это вакцины, в которых нужные микробные антигены экспрессируются клетками других микробов, используемые в качестве вектора.

Традиционно вакцины подразделяют на живые, убитые и субъединичные

Живые вакцины конструируются на основе ослабленных штаммов микроорганизмов, потерявших вирулентность, но сохранивших антигенные свойства. Живые вакцины при введении в организм приживляются, размножаются, вызывают генерализованный вакцинальный процесс и формирование специфического иммунитета к патогенному микроорганизму, из которого получен аттенуированный штамм.

Убитые вакцины представляют собой инактивированные физическими (температура, УФ-лучи, ионизирующее излучение) или химическими (формалин, фенол) способами культуры патогенных или вакцинных штаммов бактерий и вирусов. Вакцинацию проводят 2-3 раза путем введения препарата: парентерально, внутримышечно, аэрозольно, иногда перорально.

Субъединичные вакцины. В них традиционно используют отдельные иммуногенные компоненты микроорганизмов, выделенные химическим путем.

Главный вывод, который следует из практики применения субъединичных вакцин - использование отдельных компонентов микроорганизма может вызвать иммунный ответ, достаточный для предотвращения инфекции, и, в то же время, избежать побочных эффектов, связанных с введением целостного патогенного агента. В отличие от живых вакцин, которые могут вернуться к исходной вирулентной форме, хорошо очищенные субъединичные вакцины безопасны в плане возникновения инфекции. Однако применение субъединичных вакцин также сопряжено с рядом проблем экономического, технологического, медикобиологического и социального характера:

Длительное культивирование патогенных бактерий, простейших или вирусов для производства иммуногенных компонентов в промышленных масштабах обходится весьма дорого.

Большие затраты связанны с очисткой и детоксикацией вакцинных препаратов.

Почти всегда сохраняется риск, связанный с утечкой инфекционного агента.

Нельзя полностью исключить побочных эффектов.

В ряде случаев, часто в связи с высокой изменчивостью естественного инфекционного агента, не удается выделить иммуногенный компонент, способный вызвать эффективный иммунный ответ.

С развитием методов молекулярной биологии появилась возможность выявлять, изолировать и клонировать биологические макромолекулы либо их фрагменты, которые могут использоваться в качестве иммуногенных компонентов. Молекулярные конструкции, собранные из таких компонентов, составляют основу субъединичных вакцин нового поколения. Они обладают следующими приемуществами:

Применение относительно дешевых и безопасных технологий при создании и производстве вакцинных препаратов. Так, при производстве вакцин на основе достаточно коротких пептидов (до 30 аминокислотных остатков) целесообразно применять химический синтез. В других случаях используют рекомбинантные продукты, которые можно производить в экономических системах экспрессии, от бактериальных или вирусных векторов до растений.

Использование минимальных иммуногенных фрагментов и легкость очистки существенно снижают риск возникновения побочных эффектов.

Возможность разработки препаратов для перорального приема. В этом случае иммуноген попадает в организм через естественные ворота инфекции - слизистые оболочки, которые обладают хорошо развитой системой иммунного контроля. Кроме того, устроняются все осложнения, связанные с инъекциями. Последние, как известно, все чаще вызывают негативную реакцию среди населения развитых стран.

И, наконец, целенаправленное выявление участков молекул, перспек-тивных для создания вакцинных конструкций, осуществляется в самом начале работы. В связи с быстрым увеличением объема доступной информации о геномах микроорганизмов и разработкой соответствующего аналитического инструментария появилась возможность проводить поиск потенциальных иммуногенных компонентов на основе компьютерного анализа структуры биополимеров, прежде всего их первичной структуры, представленной в виде символьных строк - нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

Табл.1 Основные типы используемых в настоящее время вакцин

Основные типы вакцин Тип антигенного препарата Примеры вакцинЖивые микроорганизмыШтаммы дикого типаВирус коровьей оспы (против натуральной оспы), микобактерии - возбудители мышиного туберкулеза (из истории противотуберкудезной вакцинации)Ослабленные (по иммуногенности), или атенуированные штаммыПоливалентная (оральная вакцина Сейбина против полимиелита), коревая и паротитная, против краснухи, против желтой лихорадки (штамм 17D), против ветряной оспы\опоясывающего лишая (герпесвирус 3 человека), БЦЖУбитые микроорганизмывирусыПолиовирусная Солка, против гриппа, гепатита А, бешенствабактерииКоклюшная, брюшнотифозная, холерная, сыпнотифозная, противочумнаяСубклеточ-ные фрагменты микробных клетокКапсульные полисахариды Пневмококковая, менингококковая, против Haemophilus influenzaeПоверхностный антигенПротив гепатита ВАнатоксиныСтолбнячная, дифтерийнаяЧрезкожная иммунизация токсины, вакцинные антигены Кожные пластыри - против столбняка, бешенства, дифтерии, гриппаВакцины - леденцы Сахар трегалоза + белковые молекулы Стадия разработки.Микрокапсу-лированные вакциныДля получения используются биодеградирующие микросферы, которые с одной стороны предохраняют антиген от вредного влияния окружающей среды, а с другой стороны распадаются и освобождают антиген в заданное время. Комплексная вакцинация против нескольких инфекций одновременно. Испытывается в экспериментальных условиях.Синтетичес-кие пептидные вакцины Синтетические пептиды.Экспериментальные вакцины получены против дифтерии, холеры, стрептококовой инфекции, гепатита В, гриппа, ящура, клещевого энцефалита, против пневмококковой и сальмонелезной инфекции.На основе рекомбинантных ДНКПолученный путем клонирования и экспрессии гена; полученный методом включения генов в экспрессируемые векторы. Чистая ДНК. Против гепатита В (экспрессия в клетках дрожжей), эксперементальные препаратыАнтиидиотип-ические вакциныВакцины на основе антиидиотипических антител, являющиеся «зеркальным отражением» и способные вызывать иммунный ответ. Экспериментальные вакцины на основе идиотипов получены к возбудителям вирусных, бактериальных и паразитарных заболеваний.

Самыми эффективными среди всех бактериальных вакцин считаются столбнячная и дифтерийная вакцины, приготовленные из инактивированных экзотоксинов. Столбнячный анатоксин, кроме применения в качестве вакцины против столбняка, используется еще и как носитель в вакцинах, состоящих из коротких пептидов, которые иначе лишены иммуногенности. Такой способ эффективен благодаря тому, что население в большинстве вакцинировано против столбняка и обладает Т-клетками иммунологической памяти, распознающими токсин. Однако целесообразно использовать в качестве носителя белок того же микроба, против которого направлена конструктируемая вакцина (в частности, пневмококовая, малярийная и т.д.) (табл 2).

Иммунная система (главным образом В-клетки и антитела) распознает прежде всего поверхностные антигены большинства микроорганизмов и отвечает на них. Они служат безвредной и эффективной вакциной в тех случаях, когда вторичное образование антител способно сдерживать инфекцию.

Табл.2. Вакцины на основе фрагментов микробных клеток

Вакцины на основе фрагментов микробных клеток МикроорганизмКомментарийБактерииNeisseria meningitidisЭффективны группоспецифические полисахариды А и С; полисахарид группы В неиммуногененStreptococcus pneumoniaeИзвестны 84 серотипа пневмококков; вакцины содержат не менее 23Neisseria gonorchоeaeНе очень эффективнаEcherichia coliИспользуется в ветеринарииHaemophilus Influenzae Все полисахаридные вакцины требуют коньюгации с белковым носителемВирусыВирус гепатита АЗащищает более 95 % вакцинированных

Наиболее удачными оказались вакцины против инкапсулированных бактерий, капсульные полисахариды которых удается получить в препаративных количествах, и против вируса гепатита В, обладающего необычным свойством сверхсинтеза поверхностного антигена (НВs).

2.4 Разработка вакцинных препаратов

Если установленно, что защиту обеспечивает небольшой пептид, удобнее, возможно, получать его путем синтеза или клонирования в подходящем векторе экспрессии. Пример успешной реализации этого подхода - получение HBs-антигена, клонированного в клетках дрожжей. Изготовленная таким способом вакцина вытеснила теперь HBs-вакцину первого поколения, которую приходилось готовить трудоемким методом выделения HBs-антигена из крови носителей вируса и последующей очистки.

Привлекательность молекулярного клонирования заключается в том, что в продукт можно ввести дополнительные последовательности, например необходимые В- и Т-клеточные эпитопы, скомбинированные различным образом для оптимизации иммунного ответа. Т-клетки распознают линейные аминокислотные последовательности, тогда как В-клетки отвечают на трехмерную конфигурацию эпитопов антигена. Поэтому пептиды хорошо функционируют в качестве Т-клеточных эпитопов, но не способны имитировать структурированные В-клеточные эпитопы. Даже в том случае, если В-клеточная детерминанта имеет линейную конфигурацию, антитела, полученные к свободному гибкому пептиду, не связываются с ним так же оптимально, как с идентичной последовательностью в составе нативного белка, где она имеет более жесткую структуру.

Дальнейшее развитие подхода с применением клонирования генов предполагает введение нужного гена в такой вектор, который способен после инъекции в организм обеспечивать репликацию и экспрессию с образованием большого количества антигенов in situ.

При разработке вакцины, прежде всего, нужно определить эффекторные механизмы иммунного ответа, которые должны быть реализованны в ответ на введение препарата. Разные типы вакцинных конструкций индуцируют различные эффекторные механизмы. Синтетические пептиды или рекомбинантные белки вызывают, в основном, ответные реакции В-клеток и Т-клеток, с возможной Т-хелперной стимуляцией гумморального иммунитета. Для индукции цитотоксического иммунитета нужны другие носители - такие как вирусные векторы или ДНК-вакцины. Необходимо принимать в расчет и реакцию организма на адъюванты.

Важно учитывать и тип антител, которые индуцируются при данном способе введения. В тех случаях, когда воротами инфекции служат слизистые оболочки (самый распространенный из естественных способов инфицирования), антитела типа IgА играют ведущую роль в реакциях гуморального иммунитета. В связи с этим вполне обоснована разработка вакцинных препаратов, которые могут вводиться per os.

Вакцины должны обладать достаточной иммуногенностью; в случае убитых или субъединичных вакцин ее нередко требуется повышать, применяя адъювант.

.5 Адъюванты липидной природы, виды адъювантов

Адъювант - вещество, неспецифически стимулирующее иммунный ответ на антиген.

Свободный антиген обычно быстро распространяется из места инъекции и подвергается элиминации из организма, что отрицательно сказывается на иммунном ответе. Принцип действия некоторых адъювантов как раз и заключается в том, что они создают резервуар, в котором антиген длительное время сохраняется либо в свободном виде во внеклеточном пространстве, либо внутри фагоцитирующих клеток, обеспечивая таким образом прелангацию процессинга и презентацию антигена.

В 1920-х гг. при разработке гетерологических сывороток для терапии инфекционных заболеваний человека было обнаружено, что некоторые вещества, в частности соли алюминия, добавленные в раствор антигена или эмульгированные в нем, весьма усиливают образование антител, т.е. проявляют качества адъювантов. Гидрооксид алюминия до сих пор широко используется, например, в вакцинах, содержащих дифтерийный и столбнячный анатоксины. Воздействие адъювантов на иммунный ответ в основном обусловлено, как предполагается, двумя их активностями:

1. способностью удерживать (или даже накапливать) антиген в том месте, где он экспонируется лимфоцитами (эффект депо);
2. способностью модулировать иммунокомпетентные клетки, приводя иммунную систему к более высокой функциональной готовности, при ответе на антигенное раздражение.

Соли алюминия действуют вероятно, главным образом как депо, индуцируя образование мелких гранулем, в которых они задерживаются вместе с адсорбированным антигеном. Адъюванты нового поколения, такие как липосомы и иммуностимулирующие комплексы (ИСКОМ), позволяют достичь той же цели; заключенный в них антиген доставляется к антигенпрезентирующим клеткам.

Наиболее известен полный адъювант Фрейнда (ПАФ), применяемый только для иммунизации лабораторных животных; он представляет собой масляную суспензию убитых клеток Mycobacterium tuberculosis; перед введением животному этот препарат эмульгируют в водном растворе антигена. Адъювантный эффект, по-видимому, обусловлен именно тем, что антигенспецифический иммунный ответ развивается в лимфоидной ткани, уже содержащей упомянутые фармакологически активные бактериальные продукты. Ответ на введеный без них, чистый бактериальный антиген можно рассматривать как искусственную ситуацию, которая не встречается в природе.

Адъюванты бактериального происхождения, такие как клеточные стенки микобактерий, эндотоксины и др., действуют вероятно, в основном путем стимуляции образования соответствующих цитокинов. Это предположение подтверждается тем фактом, что цитокины действуют как эффективные адъюванты, особенно если связаны непосредственно с антигеном.

Цитокины - собирательное название для секретируемых лейкоцитами и иногда другими клетками молекул, опосредующих межклеточное взаимодействие при иммунном ответе.

Применение цитокинов в наибольшей степени целесообразно при вакцинации лиц, страдающих иммунологической недостаточностью, для которых вакцины обычного состава часто не эффективны.

Можно также надеяться, что применение цитокинов позволит придавать иммунному ответу нужное направление - например, когда желательно образование только Тх-1 или Тх-2 клеток памяти.

В настоящее время не существует единой формулы вакцин, которые бы работали оптимально, вызывая сильный длительный иммунитет без нежелательных побочных эффектов. Однако благодаря достигнутому прогрессу в области иммунологии и молекулярной биотехнологии, стали возможными идентификация и получение разнообразных антигенов. Но, как правило, индивидуальные очищенные антигены, например, поверхностные белки вирусов, или отдельные эпитопы проявляют слабый иммунный ответ, недостаточный для полной защиты организма. Для усиления иммуногенности они должны представляться иммунной системе надлежащим образом. С этой целью могут быть использованы различные адъюванты (табл.3).

Табл.3 Виды адъювантов

Виды адъювантовадъювантПрименяется при вакцинации населенияЭксперементальная стадия разработки или слишком высокая токсичность для человекаНеорганичес-кие соли1)гидрооксид алюминия (алгидрогель) 2)фосфат алюминия 3)фосфат кальцияГидрооксид берилияСистема доставки1)липосомы 2)иммуностимулирующие комплексы 3)блок-сополимеры 4)препараты пролонгированного высвобождения 5)БЦЖБактериаль-ные продуктыBordetella pertussis (с дифтерийным и столбнячным анатоксином)1)mycobacterium bovis & масло (полный адъювант Фрейда) 2)мурамилдипептидПриродные медиаторы (цитокины)1)ИЛ-1 2)ИЛ-2 3)ИЛ-12 4)ИФННекоторые лекарствен-ные препаратыЛевамизол, дибазол, препараты тимуса (тималин,Т-активин, тимоген и др.)Полисаха-риды, производные нуклеиновых кислот, синтетические полинуклеотидыЗимозан, продигиозан, нуклеинат натрия.Поли И:Ц

Система доставки типа микрочастиц, обеспечивающая защиту включенных в нее антигенов от агрессивных факторов внешней среды и способные формировать усиленный иммуный ответ, называется носителем. Наиболее известны два вида носителей:

1. на основе фосфолипида - это липосомы
2. на основе фосфолипида, холестерина и сапонина Quill A - ИСКОМы.

.6 Липосомы

Структура липосом. Липосомы - полые частицы, содержимое которых ограниченно мембраной, образованной двойным слоем молекул. Липосомы образуются при механическом диспергировании взвеси набухших фосфолипидов в воде. В качестве липидной фазы липосом обычно используют фосфотидилхолин - основной компонент биологических мембран.

Свойства липосом. Важнейшим свойством липосом является их способность включать в себя и удерживать вещества белковой природы. Мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов, что определяет их качества. Они не токсичны, биодеградируемы, при определенных условиях могут поглащаться клетками, их мембрана может сливаться с клеточной мембраной, что приводит к внутриклеточной доставке их содержимого (рис. 1).

Рисунок 1 Способы проникновения содержимого липосом в клетку

Встраивание белков в липидный бислой обычно называют реконструкцией, а получаемые при этом белоксодержащие липосомы - протеолипосомами (Борсуков Л.И.,1998). Иммуноадъювантное действие протеолипосом стало одним из главных направлений их практического применения. Наибольший интерес у исследователей для реконструкции очищенных вирусных антигенов в липосомы привлекли поверхостные гликопротеины вируса гриппа - геммаглютинин (ГА) и нейраминидаза (НА), которые являются его основными протективными антигенами, но в очищенном виде обладают низкой иммуногенностью. Используя иммуноадъювантные свойства липосом, многие отечественные и зарубежные исследователи проводят интенсивный поиск методичиских подходов для увеличения антигенной активности субъединичных грипозных вакцин. Механизм усиления липосомами иммунного ответа на инкорпорированный антиген до конца неясен. Высказывается мнение о том, что это связано с депонирующим эффектом - медленным высвобождением антигена, а также способностью везикул и связанного с ними антигена мигрировать в региональные лимфотические узлы в месте инъекции и потенцировать иммунный ответ.

Получение липосомальных препаратов.

Рядом исследователей предложены методы получения липосомных препаратов:

1. метод, в котором фосфолипиды высушивают на носителях из хлорида натрия или сорбита. При последующем добавлении воды к высушенным фосфолипидам (пролипосомам) последние набухают, в то время как носитель быстро растворяется. В этот момент формируются липосомы. Если с пролипосомами смешать различные белки или целые вирусные частицы в сухом виде, то при добавлении воды формирующиеся липосомы их захватывают с эффективностью от 65 до 100%. Таким способом получены липосомный инсулин, интерлейкин - 1, бета-каротин и инактивированная гриппозная вакцина.
2. для включения антигенов в липосомы можно использовать метод, основанный на дегидрации заранее сформированных липосом путем их лиофильного высушивания с последующей регидратацией. Полученные этим методом протолипосомы включают в себя до 40 % использованного ГА и оказывают иммунноадъювантное действие при внутримышечном введении мышам.

Достоинства и недостатки, связанные с использованием липосом.

Липосомы не только оказывают иммуноадъювантное действие, но и могут усиливать репродукцию вируса в клетках. В литературе описан феномен стимуляции липосомами экспериментальной гриппозной инфекции. Интарназальное введение пустых липосом одновременно с патогенным вирусом белым мышам приводило к значительному увеличению инфекционного титра вируса в суспензии легочной ткани и резкому увеличению числа погибших животных. Авторы объясняют полученные результаты возможной дестабилизацией липидного бислоя плазматических мембран чуствительных к вирусу клеток при действии липосом, возникающей в результате усиления эндоцитоза или слияния мембран. Эти процессы могут увеличивать эффективность проникновения вируса в клетки и их надо учитывать при использовании липосомных препаратов. По-видимому, включение липосом в состав живой грипозной вакцины может позволить снизить дозу препарата, необходимую для получения специфического иммунного ответа.

Итогом интенсивных научных поисков получения эффективных липосомальных иммунопрепаратов, разрешенных для применения на людях, явилась виросомная вакцина против гепатита А. Эффективность и практическое применение других разработанных виросомных вакцин, по оценкам авторов, пока неоднозначны и требуют дополнительных исследований.

Липосомы и их уникальные свойства продолжают оставаться объектом внимания ученых разных стран как перспективная модель для разработки вакцин нового поколения. Включение в липосомы иммуномодуляторов (индукторов гамма-интерферона) может быть использовано при создании комплекснвх препаратов для вакцинопрофилактики. Такая конструкция позволит обеспечить не только эффективную адресную доставку антигена к иммунокомпетентным клеткам, но и сбалансированную стимуляцию гуморального и клеточного иммунитета с расширенным спектром защиты на длительный срок. (Мигунов А.И. и соавт.2001).

.7 Искомы

Структура ИСКОМ.

ИСКОМы (иммуностимулирующие комплексы) как потенциальные средства транспортировки антигенов впервые были описаны в 1984 году. Десятью годами ранее появились сообщения о том, что при выделении вирусных субъединиц с использованием сапонина в качестве детергента образуются субмикроскопические структуры в качестве артефактов, но в то время не было оценено значение сапонинов для конструирования субъединичных вакцин.

В настоящее время смесь тритерпеновых гликозидов Quill A, экстрагируемых из коры южноамериканского дерева Quillaja saponaria , является обязательным компонентом классических ИСКОМ. Основой химической структуры этих сапонинов является гидрофобный тритерпеновый или стероидный агликон, к которому присоединяются два гидрофильных углеводных остатка. Благодаря углеводной части Quill A растворим в воде. Установлено, что сапонины из Quillaja saponaria обладают адъювантным эффектом не только при парентеральном, но и при пероральном введении в организм.

Отрицательное действие составляющих ИСКОМ.

К сожалению, одновременно с этим Quill A, проявляет токсическое действие, уровень которого зависит от способа введения. Очень низкая токсичность наблюдается при пероральном применении сапонинов. Напротив, при внутривенном введении возникает высокая гемолитическая активность Quill A, которая вероятно является главной причиной токсичности этого препарата. Поэтому применительно к человеку рассматривается только пероральное использование Quill A, хотя было показано, что внутримышечное введение может вызывать только умеренное гистопатологическое и никакого гематологического побочного действия у животных. В связи с этим ведутся поиски нетоксичной фракции Quill A, которая обладала бы не меньшей ИСКОМ-образующей способностью, чем исходная фракция. Вероятно, некоторые фракции тритерпеновых гликозидов (QS-21, QH-A, QH-B и QH-C), выделенные из растения Quillaja saponaria (Molina), можно рассматривать как перспективные адъюванты для человеческих вакцин.

Получение ИСКОМ.

Для получения ИСКОМ используют гидрофобный белковый антиген, который солюбилизируют детергентами (тритон Х-100, октилглюкозид, MEGA-10 и др.), которые затем удаляют в результате диализа или гель-хроматографии. Сегодня еще не выработаны критерии, с помощью которых можно было бы предугадать возможность встраивания какого-то определенного белка в ИСКОМы. Очень гидрофобные белки, которые не могут быть представлены в мономерной форме, встраиваются неэффективно. Очень большие белки также слабо встраиваются из-за стерических препятствий. Поскольку ИСКОМы очень маленькие частицы (около 40 нм), у которых отсутствует внутренний объем, водорастворимые, гидрофильные белки обычно не инкапсулируются. В этом случае частичная денатурация белка может способствовать экспонированию их гидрофобной части и улучшению встраивания в целом гидрофильного белка. Другой способ состоит в конъюгации белка или пептида с липидом.

Кроме того, для создания частиц ИСКОМ de novo требуется липидные составляющие, чаще всего фосфолипиды. Наиболее предпочтительным фосфолипидом является фосфатидилэтаноламин. Использование фосфатидилхолина вместо фосфатидилэтаноламина приводит к образованию ИСКОМ-подобных частиц с более низкой плотностью, гетерогенных по размеру и морфологии. ИСКОМы могут образовываться и без фосфолипида, но его присутствие необходимо для включения антигена.

Обычно в состав ИСКОМ входит 60-70% Quil A, 10-15% холестерина и фосфолипида и 5-20% белкового антигена. Основу ИСКОМ составляют образующиеся в результате взаимодействия сапонинов с холестерином гликозид-холестериновые комплексы.

В начале 60-х годов прошлого века на электронных снимках было зарегистрировано образование округлых ИСКОМ-подобных пор размером около 20-30 нм на эритроцитарных и липосомальных мембранах, содержащих холестерин при воздействии на них сапонинов из Q. saponaria. Позже было показано, что гликозиды голотурий образуют аналогичные структуры в мембранах, содержащих холестерин. Это косвенно свидетельствует о том, что гликозиды голотурий также способны формировать ИСКОМы. Для объяснения мембранолитической активности сапонинов (тритерпеновых и стероидных гликозидов) была предложена модель поры, которую формируют мономерные гликозид-холестериновые комплексы.

Рисунок 2. Структура ИСКОМ.

Под электронным микроскопом негативно контрастированные препараты ИСКОМ выглядят как сферические агрегаты, состоящие из 20 субъединиц с черными дырами в центре (рис.2) (Kersten G. F. A. 2003). Из чего был сделан вывод, о том, что субъединицы - это кольцеобразные мицеллы с порой посередине. Кольцо мицеллы образовано монослоем из чередующихся молекул Quill A, холестерина и фосфолипида.

Соотношение между ними определяет поведение агрегата. Благодаря тому, что в молекулах Quill A по обе стороны от гидрофобного агликона располагаются две углеводные цепочки, одна из которых содержит остаток глюкуроновой кислоты, мицеллы и сами ИСКОМ при нейтральной рН заряжены отрицательно. Электростатическое отталкивание способствует поддержанию коллоидного состояния ИСКОМ. Поведение агрегата зависит от соотношения Quill A: липида. При высоком соотношении (более 4, по массе) образуются отдельные мицеллы, поскольку достаточно большое количество углеводных групп Quill A экранируют их наружную поверхность. Снижение количества Quill A приводит к агрегации мицелл в результате увеличения гидрофобности их поверхности. Присутствие фосфатидилэтаноламина также способствует более рыхлой упаковке мицелл внутри ИСКОМ.

Способ действия.

Способ действия ИСКОМ в составе вакцин, прежде всего, определяется присутствием в них Quill A, хотя до сих пор не известен точный механизм его адъювантного действия. Интересно, что мицеллярный раствор Quill A проявляет меньший адъювантный эффект по сравнению с ИСКОМами. Сильная гемолитическая активность Quill A вероятно связана с образованием комплексов с мембранным холестерином. Это в свою очередь вызывает воспалительную реакцию в месте введения ИСКОМ, к которому привлекаются лимфоциты и макрофаги («эффект депо»). Но местная воспалительная реакция возможно не единственная причина адъювантной активности, поскольку воспалительную реакцию можно устранить без потери адъювантной активности добавлением липосом, содержащих холестерин. In vitro ИСКОМы вызывают такой же иммунный ответ, что и липосомы или интактные вирусы. Но гуморальный ответ, который вызывают ИСКОМы in vivo, в 20 и 60 раз выше по сравнению с липосомами и интактными вирусами соответственно.

Важной особенностью действия ИСКОМ на организм животных является повышенный уровень антител, а также сильный Т-клеточный ответ, рестриктированный как по МНС-I, так и по МНС-II классам. В частности, это действие было показано на мышах с использованием разных вирусных антигенов. Причем стимуляция Т-клеток типа Th1 сопровождается образованием интерлейкина-2 и интерферона (IFN-?). ИСКОМы также стимулируют синтез интерлейкина-1 спленоцитами мышей, который, в свою очередь, способствует привлечению нейтрофилов к месту инъекции ИСКОМ и спонтанной пролиферации спленоцитов. Парентеральная иммунизация с помощью ИСКОМ вызывала широкий круг эффекторных иммунных реакций, включая все классы IgG и клеточно-опосредованные иммунные ответы, такие как гиперчувствительность замедленного типа in vivo, антиген-специфический пролиферативный ответ и продукция цитокинов in vitro. В разных работах были подробно рассмотрены специфические CD4+-зависимые иммунные ответы, которые сопряжены с Th1- и Th2-зависимыми эффектами, что видно и по IgG изотипам, и по продукции интерлейкинов.

Перспективы модификации состава ИСКОМ.

ИСКОМы представляют собой гибкую конструкцию, любой компонент которой, в принципе, может быть замещен другим соединением. Это касается даже тех компонентов, которые являются структурообразующими. В качестве липидных составляющих ИСКОМ чаще всего используются основные мембранообразующие липиды - фосфатидилэтаноламин (ФЭ) и фосфатидилхолин (ФХ). Спектр иммуноадъювантных свойств ИСКОМ можно расширить путем включения вместо этих неиммунотропных фосфолипидов других амфифильных молекул, обладающих иммуномодулирующей, противоопухолевой и другими видами биологической активности.

В качестве источника таких веществ могут быть использованы морские макрофиты (макроводоросли и травы), которые, как известно, обладают различной биологической активностью (бактерицидной, антивирусной, противовоспалительной и иммунотропной), благодаря чему эта широко распространенная и филогенетически разнообразная группа растений привлекает внимание диетологов, фармацевтов, биотехнологов и других специалистов. Возможно, что различные виды биологической активности морских макрофитов связаны с высоким содержанием гликоглицеролипидов (моногалактозилдиациглицерин (МГДГ), дигалактозилдиацилглицерин (ДГДГ) и сульфохиновозилдиацилгицерин (СХДГ)) (Рис. 3).

МГДГ ДГДГ СХДГРис. 3. Химическая структура гликоглицеролипидов

R1 и R2 - углеводородные цепи остатков жирных кислот, - (-СН2)n-CH3)

До сих пор биологическая роль гликоглицеролипидов недостаточно изучена, хотя известно, что МГДГ из зеленых водорослей проявляет противоопухолевое действие, а СХДГ из морских водорослей ингибирует ДНК-полимеразу и обратную транскриптазу вируса иммунодефицита человека. Ничего неизвестно и об адъювантных свойствах этих веществ, однако полисахариды и другие гликоконъюгаты часто проявляют подобные свойства, и некоторые из них используются как адъюванты. В отличие от ФХ и ФЭ, эти три гликолипида доминируют в тилакоидных мембранах хлоропластов, где собственно протекают фотосинтетические процессы в растениях, тогда как ФХ и ФЭ в основном локализованы в нефотосинтезирующих мембранах, к которым в том числе можно отнести мембраны животных и бактерий. Таким образом, многие мембраны содержат неламеллярные (небислойные) липиды (ФЭ и МГДГ), которые благодаря своей внутренней структуре и/или электрохимическим свойствам, предпочитают не образовывать планарный бислойный агрегат в водной среде, и ламеллярные, или бислойные липиды (ФХ, ДГДГ, СХДГ), наоборот, предпочитающие самоорганизовываться в соответствующие надмолекулярные ансамбли. По-видимому, соотношение между ламеллярными и неламеллярными липидами имеет важное функциональное значение в пойкилотермных организмах, где относительные количества этих липидов изменяются в ответ на изменения условий окружающей среды. Более того, установлено, что даже в живых системах возможна замена небислойного фосфолипида на чужеродный небислойный гликоглицеролипид, что сопровождается улучшением некоторых функциональных свойств как мембраносвязанных белков, так и клеток в целом. Вероятно, бислойные фосфолипиды также могут замещаться соответствующими гликолипидами. В связи с этим мы предположили, что в качестве наиболее адекватной замены ФЭ или ФХ в составе ИСКОМ, можно использовать родственные им по структурно-функциональным свойствам гликолипидные соединения морских макрофитов.

Необходимо также отметить, что биологическая активность морских макрофитов связана с присутствием в них полиеновых жирных кислот, которые, как известно, в больших количествах входят в состав гликоглицеролипидов. Морские макрофиты относятся к группе пойкилотермных организмов и высокочувствительны к изменениям температуры окружающей среды. Колебания температуры, прежде всего, влияют на состав жирнокислотных остатков и, следовательно, фазовых переходов мембранообразующих липидов пойкилотермных организмов. В свою очередь температура фазовых переходов липидов может влиять на иммуногенность и иммуноспецифичность липид-белковых комплексов таких как, например, ИСКОМы.

Принимая во внимание все эти обстоятельства, была исследована ИСКОМ-формирующая способность разных по физико-химическим свойствам гликоглицеролипидов, выделенных из морской бурой водоросли Laminaria japonica. Помимо того, что МГДГ, ДГДГ и СХДГ ламинарии различались по количественному составу жирных кислот, тепловым переходам, характеру суперструктур в водной среде, они также обладали разной степенью гидратации. С помощью электронной микроскопии и ультрацентрифугирования было показано, что три гликолипида существенно отличались и по ИСКОМ-образующей способности. Включение самого ненасыщенного и наименее гидратируемого среди исследованных гликолипидов, МГДГ, не имели кольцеобразную форму с порами и коэффициент седиментации 19S, типичный для ИСКОМ (рис.4). Замена МГДГ на ДГДГ приводила к снижению ИСКОМ-образования, тогда как в присутствии СХДГ ИСКОМ вообще не образовывались. Вероятно, характер суперструктуры липида является определяющим для проявления ИСКОМ-формирующей способности. В частности, более эффективное включение МГДГ можно объяснить способностью к формированию инвертированной гексагональной мезофазы в водной среде, а также сравнительно меньшим гидрофильно-липофильным балансом этого гликолипида, что также может оказывать существенное влияние на адъювантные свойства амфипатических структур (Санина Н.М., Попов А.М. 2003).

2.8 Тималин (получение, применение как адъюванта)

Тималин впервые был выделен в 1974г. В.Г. Морозовым и В.Х. Хавинсоном из вилочковой железы телят. Ткань тимуса обрабатывали ацетоном, гомогенизировали, экстрагировали 3% уксусной кислотой в присутствии хлорида цинка на протяжении 72 часов и к супернатанту добавляли ацетон. Осадок многократно промывали ацетоном и высушивали. Этот комплекс полипептидов в дальнейшем подвергался дополнительной очистке, из него удаляли труднорастворимые фракции. Выделенный комплекс получил название тималин и был разрешен Фармокологическим комитетом для клинического применения в 1977 г. При эксперементальном изучении обнаружен широкий спектр фармакологической активности тималина, проявляющийся в восстановлении ряда физиологических функций организма: иммунологической реактивности, гемопоэза, гомеостаза, нейроэндокринной регуляции.

При введении интактным крысам на протяжении 2 недель тималина у них изменяются показатели иммунитета и неспецифической резистентности организма: увеличивается бактерицидная активность сыворотки и содержание бета-лизинов.

Введение тималина активизирует клеточную популяцию лимфоидных органов, вызывает омоложение клеточного состава и усиливает миграцию клеток лимфоидной ткани. Инъекции тималина индуцируют вспышку экстрамедулярного кроветворения в селезенке, приводят к существенному увеличению содержания нормобластов.

Наиболее эффективно применение тималина при тимусзависимой иммунологической недостаточности. В опытах на животных установлено, что он стимулирует реакции клеточного иммунитета и иммунный ответ на тимусзависимые антигены. Иммуномодулирующие препараты на основе пептидов тимуса можно условно разделить на три поколения.

Препараты первого поколения представляли собой экстракты тимуса, обогащенные активными факторами. К ним относятся отечественные препараты Тималин, Тактивин, Тимоптин, а также ряд зарубежных препаратов.

Препараты второго поколения представляют собой синтетические пептиды, воспроизводящие структуру нативных пептидов тимуса. Так, Тимопоэтин (Arg-Lys-Asp-Val-Tyr) представляетсобой активный фрагмент тимопоэтина, соответствующий остаткам 32-36, а Тимоген - это дипептид (Glu -Trp), присутствующий в свободной форме в экстрактах тимуса.

Наконец, третье поколение иммуномодуляторов этой группы представляет собой синтетические пептиды, являющиеся модифицированными аналогами природных пептидов тимуса. К ним относятся Имунофан, Тимодеприсин (D-изомер Тимогена).

Основная область клинического применения этих препаратов - иммуностимуляция. Поскольку установленно, что тимусные пептиды оказывают стимулирующее действие, помимо Т-клеток, на естественные киллеры и дендритные клетки, их стали применять (в сочетании с химиотерапией) для лечения злокачественных опухолей. Показано, например, что THF-g2 в сочетании с химиотерапией оказывает антиметастатический эффект при раке легкого. При клиническом использовании такого пептида, как имунофан, учитывается антиоксидантный эффект. Наконец, оптический изомер Тимогена Тимодеприсин проявил иммунодепрессивное действие и испрользуется для предотвращения реакции трансплантант-против-хозяина при пересадках аллогенного костного мозга.

Эффект тимических препаратов, как правило, комплексный (то есть в целом оптимизирующий иммунную систему) и не бывает резко выраженным. Эти препараты рассматриваются как мягкие иммуномодуляторыи, практически, не вызывают осложнений.(Хавинсон В.Х. и соавт.2002).

Таким образом, Тималин и другие препараты тимуса могут быть кандидатами к применению и в качестве адъювантов, обеспечивая мягкое многокомпонентное действие на иммунную систему, повышение дифференцировке ее клеточных элементов, оптимизируя межклеточную кооперацию и результируясь в переходе иммунной системы на более качественный структурно-функциональный уровень.

В рамках стратегии с применением иммуномодулятора мы добавили в ИСКОМный матрикс и в ТИ-комплекс известное иммунотерапевтическое средство тимического происхождения - официнальный препарат Тималин производства Микроген (Россия, Уфа), комплексом пептидов, обладающими иммуномодулирующим действием. Тималин вводили внутрибрюшинно самостоятельно и в составе комплексов в дозе 300 мкг/мышь.

.9 Порины - антигены белковой природы.

Порины принадлежат к бета-структуированным интегральным мембранным белкам, образующим в нативной мембране олигомерные структуры (чаще тримеры). По своим фиэико-химическим свойствам порины представляют собой слабокислые белки, имеющие необычайно большое для интегральных белков количество полярных аминокислотных остатков. В стабилизации пространственной структуры поринов как в наружной мембране, так и в изолированном состоянии помимо гидрофобных взаимодействий существенную роль играют водородные и ионные связи. Именно этим обусловленна необычайная устойчивость этих белков к протеазам, повышенной температуре и другим денатурирующим факторам. Основной структурной особенностью поринов является отсутствие в их полипептидной цепи достаточно протяженной последовательности, состоящей из гидрофобных аминокислотных остатков, подобной той, что «прошивает» мембранный бислой в случае альфа-спирализованных мембранных белков.

Роль поринов по осуществлению контроля за проницаемостью наружной мембраны бактерий связана с конформационной пластичностью этих белков, т. е. способностью образовывать множество конформационных состояний (интермедиаторов). Эти свойства поринов используются клеткой для адаптации бактерий к изменению условий окружающей среды. Как правило, в клетке существуют различные популяции поринов с высокой степенью гомологии на уровне первичной структуры, но с различным диаметром пор. Клетка регулирует проницаемость наружной мембраны посредством экспрессии поринов с меньшим или большим диаметром пор в ответ на изменение условий и воздействие различных факторов внешней среды.

На современном этапе развития иммунологии и вакцинопрофилактики основным критерием при выборе антигена для вакцинации стало обеспечение возможности получения водоспецифического иммунитета, а также эффективной защиты от аэрогенного инфицирования. Препараты, созданные на основе белков наружной мембраны бактерий, и прежде всего поринов, могут защищать от инфекции, вызваемой всеми типами данного вида микроорганизма (Портнягина О.Ю. и соавт.2004).

Порообразующий белок Yersinia pseudotuberculosis обладает рядом иммунологических особенностей, позволяющих использовать его в вакцинных препаратах. Выбор термостабильной субъединичной формы порина в качестве антигена обусловлен его низкой гемолитической активностью, более выраженными иммунными свойствами по сравнению с его нативной тримерной формой. Однако, иммуногенность этого белка, в целом, не высокая, что делает необходимым применение для иммунизации этим антигеном усилителя иммуногенеза.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали беспородных белых мышей линии СВА массой 20-25 грамм.

Фосфотидилхолин (ФХ) был получен в соответствии с методикой (Singleton et al., 1965).

Холестерин (Хол), сапонин из Quillaja saponaria (QuillA) использовали производства Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, U.S.A.).

Моногалактозилдиацилглицерол (МГДГ), дигалактозилдиглицерол (ДГДГ), сульфохиновазиндиглицерол (СХДГ) выделяли из морских водорослей Laminaria japonica, Ulva finistrata в соответствии с методикой, описанной (Sanina et al., 2003).

Кукумариозид А2-2 (КД) - тритерпеновый гликозид из Cucmaria japonica, обладающий свойствами сапонина, был предоставлен сотрудниками лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ (Заведующий лаборатории Стоник В.А.).

Иммуностимулирующий препарат «Кукумариазид» был разработан на основе комплексов, состоящих из кукумариозида А-2 (рис.4) из Cucumaria japonica и холестерина. Исследование иммуномодулирующей активности серии кукумариозидов из голотурии Cucumaria japonica показало, что в сверхнизких дозах моносульфатированные кукумариозиды оказывают влияние как на клеточное, так на гуморальное звенья иммунитета. Тритерпеновые гликозиды голотурий способны значительно стимулировать лизосомальную активность перитонеальных мышиных макрофагов. При этом сумма кукумариозидов этой голотурии не обладает мутагенной активностью и разрешена к практическому применению в ветеринарии. Но их применение в составе вакцин до настоящего времени не изучено.

Рис. 4 Кукумариозид А2-2

Данные гликолипиды обладают различной биологической активностью, что привлекает внимание диетологов, фармацевтов, биотехнологов к этой филогенетически разнообразной группе растений. Возможно, биологическая активность морских макрофитов связана с высоким содержанием гликоглицеролипидов, но их медико-биологические свойства до сих пор плохо изучены, хотя известно, что моногалактозилдиацилглицерол зеленых водорослей проявляет противоопухолевую активность. Сульфохиновозилдиацилглицерол из морских водорослей ингибирует ДНК-полимеразу и ВИЧ-обратную транскриптазу. Биологическую активность морских гликоглицеролипидов связывают как со структурой углеводной составляющей, так и с присутствием большого количества полинасыщенных жирных кислот.

Липид-сапониновые комплексы получали следующим образом: растворы холестерина и МГДГ в хлороформе при весовом соотношении холестерина и МГДГ 2:6 упаривали под вакуумом до удаления хлороформа и добавляли 3 весовые части 0,4 % водного раствора QuillA (или КД). Полученную липидную пленку суспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (pH 7,2), доводя суммарную концентрацию липидов (холестерина и МГДГ) до 2 мг, после чего липидную суспензию озвучивали ультрозвуковым дезинтегратором «УЗДН 2Т» (Россия) в течении 5 минут. Полученные данной процедурой препараты представляют собой водную суспензию липид-сапониновых комплексов, стабильную при температуре (-4º С) более трех месяцев.

Образующиеся липид-сапониновые комплексы оценивали электронно-микроскопически при увеличении X50000 как описано раннее (Ли и соавт.,2004). В зависимости от электронно-микроскопической картины образующиеся структуры разделяли на тубуляро-искомальные (ТИ) комплексы, тубулярно-липосомальные (ТЛ) комплексы, классические ИСКОМы и ИСКОМы, модифицированные заменой фосфолипида на МГДГ (ИСКОМ-МГДГ).

В качестве объектов сравнения при изучении иммуноадъювантных свойств ТИ-комплекса использовали липидные носители, способные переносить антиген и обеспечивать адъювантный эффект: ПАФ, классические ИСКОМы (на основе сапонина QuilA, холестерина и фосфатидилхолина в соотношении QuilA : Холл : ФХ = 3:2:6), ИСКОМы, модифицированные заменой ФХ на МГДГ в эквивалентных количествах (ИСКОМ-МГДГ), а также ИСКОМы, модифицированные заменой только QuillA на КД в соотношении КД : Хол : ФХ = 3:2:6 (морфологически охарактеризованные как тубулярно-липосомальные (ТЛ) комплексы).

В качестве модельного антигена использовали термически обработанную, гидрофобную, мономерную форму порообразующего белка наружной мембраны возбудителя псевдотуберкулеза Yersinia pseudotuberculosis с молекулярной массой около 36 кД.

Образцы сыворотки были анализированы на содержание антител методом ELSA (иммуноферментный метод). Анализ проводился на полистироловых микропланшетках. Лунки покрывались пориновым белком как антигены в концентрации 10 мг/л. Антиген разводили в буферном растворе натрия бикарбоната pH 9,6 и 100 мкл раствора добавляли в лунки планшета, инкубировали 2 часа при 37°С.

Планшет отмывали в фосфатно-буферном растворе pH 7,4 , содержащем 0,05% по объему Tween 20 (детергент) и высушивали. Чтобы предотвратить неспецифическое связывание: 200 мкг фосфатного буфера с 0,05% Tween 20 добавляли в лунки, планшеты оставляли на ночь при 4°С. . Затем отмывались три раза и высушивались. 100 мкл аликвоте (стандартный объем) мышинных сывороток каждого опытного образца предварительно разводили от 1:200 до 1:320 буфером, перемешивали, добавляли в лунки и инкубировали 2 часа при 37°С. Контролем служила сыворотка не иммунизированных мышей. Планшеты отмывались как указывалось выше, высушивали и добавляли 100 мкл аликвоты меченного пероксидазой антимышинного Ig (M+G) разведенного 1:1000 в контактном буфере. Планшеты инкубировались 1 час при 37°С, отмывались и высушивались. 100 мкл субстрата (Тетраметилбензидин (ТМБ)) добавляли в лунки и выдерживали в темноте при комнатной температуре 20 минут. Ферментную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 Н Н2SО4. Активность специфических антител определялась фотометрией на многоканальном спектрофотометре при длине волны 492 нм. Сыворотка не иммунизированных мышей использовалась как отрицательный контроль.

Порин-содержащие ТИ-комплексы получали из КД, холестерина и МГДГ, взятых в весовом соотношении 3:2:6, с последующим добавлением поринового белка в необходимой концентрации в ФСБ (рН 7,2) в дозах, соответствующих 0,1-1-10 мкг белка на 1 мкг содержания КД, а именно: 75 мкг, 750 мкг или 7500 мкг на 1 мл полученной смеси. Полученную смесь озвучивали ультразвуковым дезинтегратором в течение 5 мин и оставляли на 3 час. Мономерный пориновый белок из Y. pseudotuberculosis самопроизвольно включается в ТИ-комплекс. Полученный препарат представляет собой водную суспензию порин-липид-сапониновых комплексов, стабильную при температуре (-4оС) более трех месяцев. Подлинность препарата определяется качественным и количественным составом исходных структурных компонентов (КД, холестерина и МГДГ). Для оценки связывания порина с ТИ-комплексом проводили ультрацентрифугирование при 540000 g в течение 45 минут. Содержание несвязанного белка определяли в надосадочной жидкости методом Лоури (Lowry et al., 1951). Количество белка, включенного в ТИ-комплекс, составляло не менее 95%.

Иммунизацию мышей порином производили в/б в дозах 0,01, 0,1, 1, 10, 20, 50 мкг/мышь в объеме 0,2 мл ФСБ. Порин в тех же дозах вводили в составе ТИ-комплексов. В качестве групп контроля использовали порин в смеси с ПАФ, в составе ИСКОМ, ИСКОМ-МГДГ и ТЛ-комплексов. Мышей иммунизировали дважды: повторную иммунизацию производили через 14 дней после первой. На 6-й день после второй иммунизации мышам в подушечку одной из лапок вводили разрешающую дозу порина в половинной дозе от иммунизирующей в объеме 0,02 мл ФСБ. В контрлатеральную лапку вводили такой же объем ФСБ. Забой животных производили на 7-й день после второй иммунизации, оценивая ИВ ГЗТ в %.

Содержание специфических антипориновых антител определяли в сыворотке крови мышей методом иммуноферментного анализа в модификации (Portnyagina et al., 1999). Измерение оптической плотности производили на планшетном спектрофотометре «марка» при длине волны 492 нм. Содержание антипориновых антител выражали в единицах оптической плотности (ОП) при длине волны 492 нм.

Статистическую обработку результатов проводили методом параметрического анализа с использованием критерия t-Стьюдента и медом доверительных интервалов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Представлены результаты по модификации ИСКОМной матрицы методом замены ее структурных компонентов: фосфолипида и сапонина QuillA на структуры морского происхождения - гликолипид МГДГ и сапонин тритерпеновый гликозид кукумариозид А2-2 (КД). Показано, что в результате образуются структуры двух типов: искомоподобные структуры с характерной для них морфологией и размерами, и тубулярные структуры диаметром около 40 нм. Эти структуры названные ТИ-комплексами, характеризуются отсутствием токсичности, характерной для ИСКОМ, способностью включать амфифильный белковый антиген и обеспечивать иммуноадъювантный эффект при экспериментальной вакцинации.

При проведении замены в структуре ИСКОМ фосфолипида на гликолипиды было применено три гликолипида, выделенные методами гель-хромотографии из морской водоросли Laminaria japonica - МГДГ, ДГДГ, СХДГ. Из этих трех гликолипидов только МГДГ оказался способным заменить фосфолипид - образовывать структуры аналогичные ИСКОМам.

Рисунок 5. Комплекс МГДГ - ИСКОМы

При иммунологической оценке таких структур мы не выявили преимуществ комплекса ИСКОМ-МГДГ в сравнении с классическими ИСКОМами, что соответствует результатам других авторов, проводивших, например, замену в матрице ИСКОМ фосфолипида на сфинголипиды. К тому же, это не решало задачи по оптимизации баланса токсичности ИСКОМ и их адъювантной эффективности. Для замены QuillA был применен ряд гликозидов, полученных из морских беспозвоночных (Cucumaria japonica, Stichopos), а также - индивидуальный гликозид женьшеня RH2.

При электронномикроскопическом исследовании получаемых суперструктур, наибольший интерес вызвала замена фосфолипида на МГДГ, полученный из морской водоросли U.finistrata,и QuillA - на гликозид КД, полученный из Cucumaria japonica.

Наряду с классическими гексогональными структурами, характерными для ИСКОМ, образуются тубулярные структуры диаметром около 40 нм и длиной 150-400нм. Данная комбинация тубулярных и искомоподобных структур была названа ТИ-комплексом. Следует отметить, что для образования таких структур требуется присутствие в комплексе одновременно МГДГ и КД. Если замена фосфолипида на гликолипид сохраняет гексогональную структуру, характерную для ИСКОМ, то замена QullA на КД приводит к образованию сети тубул и липосомоподобных везикул - эти структуры названы тубулярно-липосомальными комплексами (ТЛ-комплексы). Искомоподобных структур в последнем случае не обнаруживалось. Таким образом, для эффективной модификации ИСКОМной матрицы, при которой наряду с другими структурами сохраняется присутствие классических ИСКОМ, необходимыми оказались оба компонента - гликолипид МГДГ и сапонин КД. При детальном анализе получаемых структур выявляется интересная закономерность - тубулы оказываются заполнеными искомоподобными структурами, выполняя таким образом функцию контейнера ИСКОМ, возможно, высвобождая искомные структуры порциями в процессе своей деградации и способствуя таким образом пролонгации антигенного раздражения.

Таким образом, примененная техника модификации ИСКОМ приводит к образованию принципиально новой морфологии - ТИ-комплексов, потенциальные свойства которых как адъювантных носителей антигенов были приняты к дальнейшим исследованиям.

В качестве модельного антигена использовали белок порин - небольшой амфифильный мембранный антиген Yersinia pseudotuberculosis с молекулярной массой около 36 КД. При электронно-микроскопическом исследовании установлено, что процесс взаимодействия порина с ТИ-комплексом не нарушает морфологическую структуру ТИ-комплекса. Связывание порина с ТИ-комплексами происходит с высокой эффективностью - до 95% от свободного белка включается в ТИ-комплекс. Таким образом, получается препарат порина, инкорпарированного в структуру матрицы ТИ-комплекса (то есть потенциально вакцинный препарат). При электронной микроскопии ТИ-комплексы с порином имеют ультромикроскопическую тубулярную структуру, представленную тубулами с диаметром поперечного сечения около 40 нм, сформированными искомоподобными структурами сходного диаметра при наличии последних внутри и между тубулами (рис.6).

Предваряя оценку адъювантной активности ТИ-комплексов, была проведена серия экспериментов с целью анализа собственной адъювантной активности структурообразующих частиц ТИ-комплекса: КД и МГДГ. Работами сотрудников ТИБОХ ДВО РАН ранее было показано, что КД не проявляет эмбриотоксических и мутагенных свойств, повышает неспецифическую устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям в черезвычайно низких нетоксических для организма дозах.

Рис. 6. Электронно-микроскопическая фотография ТИ-комплекса при соотношении компонентов в системе КД: холестерин: МГДГ: порин.

На следующем этапе исследований мы оценили адъювантную активность ТИ-комплексов в отношении иммунного ответа при иммунизации мышей бактериальным антигеном - субъединичным белком порином, выделенным из мембранного поринового белка Y. рseudotuberculosis. Результаты экспериментов по иммунизации мышей порином в большом диапазоне доз 0,01-0,1-1-5-10-20-50 мкг/мышь позволили выбрать в качестве оптимальной дозу в 10 мкг/мышь, которая была использована для иммунизации самостоятельно и в составе различных носителей. На рисунке 7 показаны различия в содержании специфических антипориновых антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных порином самостоятельно и в составе различных адъювантных комплексов.

Результаты данного эксперимента позволяют сделать вывод о том, что иммуногенные свойства порина слабо выражены и при самостоятельном применении он вызывает слабо выраженный специфический гуморальный иммунный ответ, практически не обеспечивающий протективного эффекта при модельной псевдотуберкулезной инфекции у мышей (данные не представлены). Применение ТИ-комплекса как носителя порина позволяет повысить выраженность этого иммунного ответа, то есть ТИ-комплекс проявляет свойства адъювантного носителя. Уровень гуморального иммунного ответа повышается, причем ТИ-комплексы оказываются более эффективными адъювантами, чем ПАФ, ТЛ-комплексы, классические и модифицированные ИСКОМы с порином. При этом следует отметить, что замена фосфолипида в структуре ИСКОМ на гликолипид обеспечивала тенденцию к повышению адъювантной активности модифицированного ИСКОМ, однако наибольший эффект обеспечивала двойная замена фосфолипида и QuillA соответственно на МГДГ и КД, то есть применение ТИ-комплекса.

Рис. 7. Показатели гуморального иммунного ответа мышей при иммунизации порином (в/б) в дозе 10 мкг/мышь самостоятельно и в составе комплексов.

По оси абсцисс - экспериментальные группы животных.

По оси ординат - концентрация антипориновых антител в ед. ОП при длине волны 492 нм.

В рамках стратегии усиления иммуномодулирующих свойств адъювантов мы применили технологию встраивания в структуру адъювантного носителя тималина - препарата тимуса, обладающего широким спектром иммунологической активности.

При применении тималина в качестве самостоятельного адъюванта в экспериментах по иммунизации мышей порином эффект тималина был малозначительным. Однако, при этом таким же оказался и эффект ПАФ, что еще раз подтверждает наше заключение о слабом иммуногеном потенциале порина. Адъювантный эффект ТИ-комплекса в данном эксперименте вновь оказался выше, чем у классических и модифицированных ИСКОМ, однако включение тималина в ИСКОМ оказалось способно поднять адъювантную активность ИСКОМ до уровней незначительно превосходящих действие ТИ-комплекса.

Результаты данного эксперимента подтверждают как правильность выбранной нами стратегии усложнения структуры матрицы адъювантного носителя путем встраивания в нее иммуноактивных препаратов, так и выбора собственно этого препарата. Для оценки вклада тималина в изменение адъювантной активности ТИ-комплексов был проведен следующий эксперимент, при котором встраивание тималина в ТИ-комплекс производили одновременно с добавлением порина (Рис. 7).

Эти результаты демонстрируют способность тималина потенцировать адъювантную активность ТИ-комплексов в отношении порина. Данный эффект наблюдается при всех испытанных разведениях сыворотки, подтверждая специфический характер данного эффекта, то есть связанный с повышением титров специфических антипориновых антител. Учитывая слабость порина как антигена и иммуногена эти результаты представляются значимыми и доказывают перспективность продолжения исследований адъювантной активности таких конструкций, как ТИ-комплексы с антигенами.

ВЫВОДЫ

1. При иммунизации животных слабым по иммуногенным свойствам белком - порином из Y. Pseudotuberculosis - ТИ- комплексы как носители порина проявляют свойства адъювантного носителя. Уровень гуморального иммунного ответа повышается более значительно, чем при применении других адъювантных носителей: ПАФ, классических ИСКОМ с порином, модифицированных ИСКОМ - МГДГ и ТЛ-комплексов.
2. Замена в матрице ИСКОМ фосфолипида на МГДГ из морских макрофитов позволяет сохранить суперструктуру и адъювантную функцию, характерные для ИСКОМ.
3. Замена в матрице ИСКОМ одновременно фосфолипида на МГДГ и сапонина QullA на кукумариозид приводит к качественному изменению образуемых суперструктур - наряду с классическими гексогональными структурами, характерными для ИСКОМ, образуются тубулярные структуры диаметром, сопоставимым с диаметром ИСКОМ (около 40 нм) и длиной 100 - 400 нм - тубулярно-искомальные (ТИ-) комплексы.
4. Добавление в структуру матрицы ИСКОМ и ТИ-комплексов иммуноактивного препарата тималина способствует повышению эффективности таких адъювантных конструкций.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Костецкий Э.Я., Попов А.М., Санина Н.М. и др. (2006) Носитель и адъювант для антигенов. Заявка на патент № 2006104795/13(005189) от 15.02.2006г.

2.Ли И.А., Попов А.М., Санина Н.М. и др. (2004) Известия РАН. Сер. биолог., 3, 299-304.

3.Портнягина О.Ю.,Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хомченко В.А., Соловьева Ф.Т. Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний. Вестник ДВО РАН. 2004 № 3.

4.Lee I.A., Popov A.M. Sanina N.M. et al. (2004) Acta Biochimica Polonica, 51, 263 -272

5.Sanina N.M., Goncharova S.N., Kostetsky E.Y. (2003) In Advanced Research on Plant Lipids. Murata et al, eds, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 385-388.

6.Ройт А., и др. Иммунология М. Мир 2000.

.Барсуков Л.И. Липосомы // Соровский образовательный журнал. 1998 № 10 с.2-9.

.Мигунов А.И.,Кузнецов О.К., Киселев О.И. Использование липосом для конструирования вакцин. НИИ гриппа РАМН, С.-Петербург 2001.

.Соболев Б.Н., Поройнов В.В., Оленина Л.В., Колесанова Е.Ф., Арчанов А.И.. Компьютерное конструирование вакцин Биомедицинская химия, 2003 том 49 № 4 с. 309-332.

.Хавинсон В.Х., Малинин В.В., Чалисова Н.И., Григорьев Е.И. Тканеспецифическое действие пептидов в культуре тканей крыс разного возраста. Успехи геронтологии, 2002 №9 с.278.

11.Kersten G.F.A., Grommelin D.J.A. Liposomes and ISCOMs // Vaccinе. 2003 V. 21. P. 915-920.