Изучение возможности применения метода амплитудного анализа лазерного излучения для изучения плотности микробных популяций и закономерностей их роста в различных условиях

Изучение возможности применения метода амплитудного анализа лазерного излучения для изучения плотности микробных популяций и закономерностей их роста в различных условиях

Цейтлин В.А., Бахир А.Н.

Изучены зависимости светорассеяния популяций Staphilococcus aureus и Esherichia coli в питательном бульоне с различными добавками и физиологическом растворе. Обнаружены заметные различия в закономерностях, показывающие зависимость светорассеяния от состояния клеточной стенки и цитоплазмы. Для клеточной суспензии в питательном бульоне показана возможность использования светорассеяния для количественного анализа плотности популяции и оценки кинетических параметров роста.

Измерение плотности популяции и параметры роста всегда представляют интерес во многих исследованиях. Популяции микроорганизмов удобны краткостью жизненного цикла, но часто оценка плотности популяций представляет большую проблему. Предложено много методов решения от простого подсчета клеток в поле видимости до использования продуктов метаболизма и различных связанных с обменом веществ параметров [1,2]. Полезным может быть использование физико-химических методов в силу их универсальности, интегральности и быстроты получения результатов. Микроорганизмы по размерам близки к типичным коллоидным системам и перспективным представляется использование методов их исследования. Важным свойством, отличающим коллоидные системы от истинных растворов, является светорассеяние, которое зависит от размерного распределения дисперсных частиц и от оптических свойств материала их составляющего.

Целью исследований была оценка возможностей метода светорассеяния в изучении микробных популяций. Использовалась установка для регистрации светорассеяния в виде амплитудного анализа лазерного излучения [3]. Основа метода состоит в зависимости номера регистрирующего канала на который приходит максимум от плотности суспензии и размеров составляющих частиц, установлен рост номера максимума с увеличением размера и увеличением количества рассеивающих частиц в единице объема системы. Для стационарной популяции можно постулировать неизменность размерного распределения клеток и зависимость рассеяния только от плотности микробной взвеси.

Для получения стандартных плотностей микробных взвесей использовался стандарт мутности на 109 клеток и создавались разведения десятичным логарифмом плотности равным: в пятом - 4, четвертом - 5, третьем - 6, втором - 7, первом - 8 и, соответственно, в нулевом - 9. Растворы использовались для построения калибровочного графика плотность популяции - номер канала, по которому в дальнейшем определялись плотности популяций для кинетических исследований.

Взвеси микробных клеток готовились на основе физиологического раствора и питательного бульона ГРМ, для изучения влияния добавок в бульон добавлялись хлорид натрия и глюкоза: к 9 мл исходного бульона добавляется 1 мл насыщенного раствора соли (36 г в 100 г воды) или 1 мл раствора глюкозы (10 г в 100 мл воды). Расчет показывает около 3% по соли и 1% по глюкозе, таким образом, следует ожидать очень заметного смещения осмотических равновесий.

Для описания роста популяций использовалась общая модель Ферхюльста-Пирла

с линеаризацией для определения параметров

светорассеяние популяция лазерное излучение

Рисунок 1. Калибровочные кривые

Обработанные по этой форме данные использовались для построения графика в координатах (v/N) - N, для получения зависимости между плотностью популяции и номером канала использовалась стандартная операция пакета Excel Microsoft Office подбора уравнения нелинейного тренда для набора точек, а для получения численных значений констант уравнения Ферхюльста-Пирла - линейногоДля сравнения данных и решения вопроса переносимости данных в физиологическом растворе для оценки роста в питательном бульоне были построены калибровочные графики для взвесей в бульоне и физрастворе. В результате собственных исследований установлено, что имеется различие очевидное графиков для обеих микробных популяций (рис.1). Причинами могут быть процессы роста в бульоне и невозможность их в физрастворе, с этим будут связаны различия в состояниях клеточных мембран и цитоплазмы. Для E. coli соотношение зависимостей в физрастворе и бульоне отлично от S. aureus., объяснить это можно из-за большей подверженности клеточных мембран кишечной палочки осмотическим воздействиям [1]. Очевидна большая применимость метода для низших разведений, для нулевого - второго разведений изменение плотности клеточной взвеси в десять раз приводит к заметному сдвигу в номере канала, а для третьего - пятого сдвиги находятся на грани ошибки метода. Для оценки ожидаемого вида кривой с учетом всех влияний можно провести среднюю аппроксимирующую линию. Большие различия зависимостей светорассеяния в бульоне и в физрастворе указывают на невозможность использования результатов в физрастворе для других растворов и необходимость построения калибровочных кривых для каждого раствора конкретно с обязательным учетом возможных процессов роста.

Рисунок 2. Калибровочные кривые

Обработанные по этой форме данные использовались для построения графика в координатах (v/N) - N, для получения зависимости между плотностью популяции и номером канала использовалась стандартная операция пакета Excel Microsoft Office подбора уравнения нелинейного тренда для набора точек, а для получения численных значений констант уравнения Ферхюльста - Пирла - линейногоДля сравнения данных и решения вопроса переносимости данных в физиологическом растворе для оценки роста в питательном бульоне были построены калибровочные графики для взвесей в бульоне и физрастворе. В результате собственных исследований установлено, что имеется различие очевидное графиков для обеих микробных популяций (рис.1). Причинами могут быть процессы роста в бульоне и невозможность их в физрастворе, с этим будут связаны различия в состояниях клеточных мембран и цитоплазмы.

Для E. coli соотношение зависимостей в физрастворе и бульоне отлично от S. aureus., объяснить это можно из-за большей подверженности клеточных мембран кишечной палочки осмотическим воздействиям [1].

Очевидна большая применимость метода для низших разведений, для нулевого - второго разведений изменение плотности клеточной взвеси в десять раз приводит к заметному сдвигу в номере канала, а для третьего - пятого сдвиги находятся на грани ошибки метода. Для оценки ожидаемого вида кривой с учетом всех влияний можно провести среднюю аппроксимирующую линию. Большие различия зависимостей светорассеяния в бульоне и в физрастворе указывают на невозможность использования результатов в физрастворе для других растворов и необходимость построения калибровочных кривых для каждого раствора конкретно с обязательным учетом возможных процессов роста.

Рисунок 2. Зависимость положения максимума для взвесей:

А- S. aur; B- E.coli.- аппроксимирующая кривая.

Для оценки возможности применения метода амплитудного анализа для изучения процессов роста была исследована зависимость светорассеяния взвесей S. aureus и E. coli во втором разведении в исходном бульоне и бульоне с добавками соли и глюкозы. Были получены следующие результаты (рис.2). Зависимости максимумов каналов и плотности популяций от времени приведены в таблицах 1 (стафилококк) и 2 (кишечная палочка). С помощью калибровочных кривых были оценены плотности популяций и кинетические параметры.

Таблица №1

t, мин. n, каналlg NN (DN/Dt) /NУравнениебез добавок02457,8737,47×107-dN/dt= (0,056-2×10-10N) N152718,1041,27×1080,0274302888,2571,81×1080,0199452948,3122,05×1080,0079602998,3582,28×1080,0067с добавкой соли01607,5243,34×107-dN/dt= (0,048-10-9N) N151707,5713,73×1070,0069301757,5953,94×1070,0035451797,6144,11×1070,0028601817,6234, 20×1070,0014с добавкой глюкозы02136,09751,25×106-dN/dt= (0,063-4×10-10N) N152307,2111,63×1070,0615302397,6134,10×1070,0403452487,8867,69×1070,0311602628,0531,13×1080,0212

Результаты линеаризации данных показывают изменение обеих констант в уравнении, но наблюдается большее изменение под влиянием добавок постоянной роста в уравнении Ферхюльста - Пирла по сравнению с константой угнетения. Наблюдается закономерный рост константы роста в ряду "бульон с солью" - "чистый бульон" - "бульон с глюкозой" для обеих популяций.

Таблица №2

t, мин. n, каналlg NN (DN/Dt) /NУравнениебез добавок02578,0531,13×108-dN/dt= (0,039-2×10-11N) N152688,3782,39×1080,0351302788,6634,60×1070,0321452868,8847,65×1080,0266602929,0451,10×1090,0207с добавкой соли01606,4632,90×106-dN/dt= (0,028-2×10-9N) N151676,6174,14×1060,0199301736,7495,61×1060,0174451776,8366,85×1060,0121601816,9238,37×1060,0121с добавкой глюкозы02137,1141,30×107dN/dt= (0,045-9×10-10N) N152307,3302,14×1070,0261302427,4783,01×1070,0193452497,5633,66×1070,0119602547,6244,21×1070,0086

Видно, что в случае бульона с добавкой соли резко возрастает константа угнетения и ее рост начинает оказывать преобладающее влияние на рост популяции.

Результаты исследования позволяют утверждать перспективность применения метода светорассеяния для исследования процессов роста и оценки плотности микробных популяций при высоких плотностях клеточных взвесей, когда другие методы дают наивысшую вероятность ошибок измерений.

Список литературы

1. Перт Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - М.: Мир, 1978. - 332с.

. Дикий И.Л. и др. Микробиология: Руководство к лабораторным занятиям. - К.: ИД "Профессионал", 2004. - 594 с.

. Овчинников А.И. Фотометр на базе гамма - спектрометра. - Физическое образование в вузах. - 2004. - Т.10, №4. - с.68 - 74.